论文部分内容阅读
[研究背景和目的]金纳米棒可在近红外光的照射下,表面自由电子产生等离子共振效应,将光能转换为热能,可有效诱导肿瘤细胞死亡,是一种物理性热疗模式。细胞死亡方式强烈依赖热刺激负荷的大小而表现出从主动程序性死亡（如凋亡、细胞衰老）到被动死亡（如坏死）之间复杂的中间形式或多种死亡方式并存的现象。本团队前期研究发现,金纳米棒可被单抗修饰,并获得肿瘤靶向性,在适当的NIR激光照射下可诱导头颈部癌细胞凋亡。但是目前具体机制尚不清楚,因此,本课题将进一步深入阐释PD-L1修饰金纳米棒诱导头颈部鳞癌细胞程序性死亡机制,为后续金纳米棒治疗头颈部鳞癌提供理论依据。[方法]1.金纳米棒偶联PD-L1抗体的制备。2.通过紫外可见分光光度计检测PD-L1mAb/AuNRs的最大光吸收峰位波长和PD-L1mAb偶联率。3.PD-L1mAb/AuNRs经EDS进行其微量元素成分分析。4.Zeta电位表征PD-L1mAb/AuNRs物理稳定性。5.CCK-8法检测头颈鳞癌细胞经PD-L1mAb/AuNRs光热作用后细胞增殖的影响。6.SA-β-Gal染色观察头颈鳞癌细胞经PD-L1mAb/AuNRs光热作用后细胞衰老现象7.CCK8检测Hep-2细胞经PD-L1mAb/AuNRs光热作用后24h、48h、72h细胞活力的影响8.流式细胞凋亡检测Hep-2细胞经PD-L1mAb/AuNRs光热作用后24h、48h、72h细胞凋亡的影响9.SA-β-Gal 染色观察 Hep-2 细胞经 PD-L1mAb/AuNRs 光热作用后 24h、48h、72h细胞衰老的情况10.免疫荧光检测PD-L1mAb/AuNRs光热作用Hep-2细胞后24h、48h、72h DNA损伤标记物γ-H2AX、8-OH-dG的表达11.western blot 检测 PD-L1mAb/AuNRs 光热作用 Hep-2 细胞后 24h、48h、72h 衰老相关蛋白P16、P21、CDK2蛋白表达[结 果]1.PD-L1mAb/AuNRs纵向带最大吸收波长为783 nm,可在生物组织中具有最大的穿透深度。2.PD-L1mAb偶联AuNRs的偶联率为34%。3.PD-L1mAb/AuNRs物理稳定性好,适用于生物医学应用。4.Hep-2细胞和CNE-2细胞经PD-L1mAb/AuNRs处理,NIR照射后6h,细胞活力显著下降,对NP69细胞活力影响效果不显著。5.PD-L1mAb/AuNRs光热效应可诱导Hep-2细胞和CNE-2细胞发生衰老。6.PD-L1mAb/AuNRs光热效应可使Hep-2细胞活力下降,且结束激光照射后,在一定时间范围内随时间的延长,细胞活力仍呈现下降趋势。7.PD-L1mAb/AuNRs光热效应可使Hep-2细胞发生明显凋亡,且结束激光照射后,在一定的时间范围,细胞凋亡率仍呈现上升趋势。8.PD-L1mAb/AuNRs在NIR照射下可抑制Hep-2细胞DNA复制,使细胞周期大多数停滞在G1期。9.PD-L1mAb/AuNRs光热效应可使Hep-2细胞衰老数量明显增多,且结束激光照射后,在一定时间范围内随时间的延长,细胞衰老数量仍呈现上升趋势。10.Hep-2细胞经PD-L1mAb/AuNRs光热效应可观察到DNA损伤标记物γ-H2AX、8-OH-dG的表达明显增多,且结束NIR照射后,在一定时间范围内随时间的延长,DNA损伤标记物γ-H2AX、8-OH-dG的表达仍呈现上升趋势,说明Hep-2细胞DNA发生损伤,增加细胞衰老程度及数量。11.Hep-2细胞经PD-L1mAb/AuNRs光热效应后,DNA损伤应答通路中正向基因蛋白P21、P16表达上调,负向基因蛋白CDK2表达下调,且结束NIR照射后,在一定时间范围内随时间的延长,P16和P21的表达量呈上升趋势;CDK2的表达量呈下降趋势。[结论]1.PD-L1mAb/AuNRs光热作用可有效杀伤头颈部鳞癌细胞。2.PD-1mAb/AuNRs光热作用可诱导头颈鳞癌细胞出现坏死、凋亡和衰老。3.PD-1mAb/AuNRs光热作用可能通过p16INK4a/Rb信号途径和p53/p21Cip1信号途径诱导Hep2细胞衰老。