【研究背景】闭塞性细支气管炎(bronchiolitis obliterans,BO)是一种累及细支气管为主的炎性损伤所致的慢性气流受限综合征,病理主要表现为细支气管的部分或完全闭塞,主要见于重症肺部感染或急性肺损伤后所致的细支气管炎性损伤后持续咳嗽、喘息、呼吸困难,常规平喘治疗无效,严重影响儿童的生长发育,并可发生严重的并发症,致死、致残率极高。根据BO所致的病因不同,可分为感染后闭塞性细支气管炎(postinfectious bronchiolitis obliterans,PIBO)、移植后BO及有毒为物质吸入后BO等,其中儿童以PIBO最为常见,多继发于严重的下呼吸道感染。PIBO发病机制尚未完全明确,目前有认为重症肺部感染后大量的炎症细胞浸润与细胞因子高分泌引起免疫活性细胞和细胞因子作用于损伤的气道黏膜上皮细胞,进而诱发的慢性进行性炎性损伤;小气道持续损伤与反复炎症刺激,气道上皮细胞增生及组织迷行修复,成纤维细胞大量增殖致过度纤维化,形成恶性循环,最终导致小气道纤维性的部分或完全闭塞。中性粒细胞为人体最多的炎症细胞,是机体抵御外来微生物入侵的第一道防线。在急性感染后及肺移植后期.体内CD4+,CD8+T淋巴细胞识别体内抗原,启动细胞免疫应答,杀伤组织细胞(或者肺泡、气道上皮)。机体在识别过程中CD4+T淋巴细胞能分泌大量的细胞因子、黏附分子以及多种趋化细胞因子[(包括IL-6、IL-8、IL-17和γ-干扰素(IFN-γ)等],诱导B淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞活化增殖。其中,活化T淋巴细胞分泌细胞因子(IL-6、IL-17和IFN-γ等)和活化气道上皮细胞分泌多种细胞因子[募集中性粒细胞和巨噬细胞的IL-18和单核细胞趋化蛋白(MCP-1)等]在PIBO的发生过程中起着关键作用。中性粒细胞的聚集链接了一系列气道上皮的损伤。感染发生后,中性粒细胞是固有性免疫系统中重要效应细胞,它可藉助Fc受体及补体受体通过吞噬、脱颗粒、ADCC(抗体介导的细胞依赖的细胞毒作用)发挥其杀伤功能;激活状态下,中性粒细胞还能产生大量的超氧阴离子和活性氧(reactive Oxygen species,ROS),这些产物具有较高的反应性,与细菌的细胞膜、核酸分子及蛋白质发生氧化还原反应,一方面发挥了对病原微生物的杀伤作用;另一方面机体异常的、持续的免疫状态可造成中性粒细胞过度趋化或持续激活,清除病灶延迟,其呼吸爆发的产物ROS及依赖于ROS的中性粒细胞脱颗粒产物可对正常组织及细胞造成损伤死亡;ROS还可上调一些细胞因子及粘附分子的表达水平,放大炎症效应。此时中性粒细胞的耗氧量激增,可达正常消耗量的2~20倍,其过程称为呼吸爆发。文献报道在慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)患者气道内存在持续的慢性气道炎症,中性粒细胞在肺内聚集增多的同时伴有清除延迟和继发性坏死增加,组织细胞的坏死引起大量趋化因子释放,募集更多中性粒细胞,使炎症持续;同时滞留的中性粒细胞可进一步导致气道黏液纤毛清除功能障碍而增强炎症反应。中性粒细胞呼吸爆发产生的ROS对于气道上皮炎性损伤及异常修复所致的气道重构同样是清除、修复、损伤的结果。抗中性粒细胞胞浆抗体(antineutrophil cytoplasmic antibodies,ANCA)是针对中性粒细胞和单核细胞胞浆成分的自身抗体。ANCA的靶抗原众多,其中髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)及蛋白酶-3(proteinase-3,PR3)是临床上最常见靶抗原,与之相对应的特异性抗体MPO-ANCA、PR3-ANCA亦是最具临床意义的抗体。在致炎因子刺激后,中性粒细胞胞浆内的PR3、MPO转移到细胞膜表面,与MPO-ANCA及PR3-ANCA相结合形成抗原-抗体复合物,激活中性粒细胞,产生活性氧及释放脱颗粒产物,参与炎症反应。本课题组前期研究在国际上首次提出了BO患儿血清中MPO-ANCA及PR3-ANCA异常升高,患儿ANCA水平随病情的改善逐渐降低。既往有文献报道,BO患者中诱导痰及肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中中性粒细胞比率增加,BALF中蛋白氧化产物增加,有中性粒细胞趋化因子白介素-8(Interleukin-8,IL-8)增多;上述指标经抗炎治疗后PMN减少,IL-8降低、氧化产物减少,病情改善。基于以上研究,我们推论ANCA与PIBO存在一定的相关性,中性粒细胞是PIBO患儿气道炎性损伤的优势表型细胞,ANCA可能通过介导中性粒细胞呼吸爆发参与了PIBO的气道炎症,这些假设有待更多的临床与基础实验验证。【研究目的】本研究旨在:1、验证PIBO患儿中气道存在以中性粒细胞为主的炎症反应;2、探讨ANCA变化水平与PMN呼吸爆发程度的相关性;3、建立中性粒细胞与气道上皮细胞共培养体系,探讨ANCA刺激中性粒细胞呼吸爆发产物与气道上皮炎性反应的相关性。本研究分三部分第一部分PIBO患儿肺泡灌洗液中细胞学分类的优势表型PIBO的发病机制尚未完全明确,目前认为气道上皮的损伤再修复为PIBO的启动因素,其中多种炎症细胞及炎症介质参与了气道上皮的损伤。肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)细胞学分类计数是气道疾病常用的检查方法,可评估气道局部炎症,但因为有创检查,难以重复;高渗盐水诱导痰细胞学检查普遍认为可反应气道疾病,BALF和诱导痰所取的气道分泌物所进行的细胞学分类结果有相似性,因此,通过检测PIBO患儿BALF行细胞分类检查,评估气道炎症细胞表型。【研究目的】确立PIBO患儿BALF细胞学分类中的优势细胞表型。【研究方法】收集2010年1月~2017年12月在我院住院诊断符合PIBO诊断、首次入院的、未经全身激素治疗、经支气管镜取BALF的PIBO患儿52例及5~7岁经高渗盐水雾化取诱导痰的正常健康儿童35例,行细胞学分类检查,分析气道分泌物细胞分类的优势表型。统计学方法:参数成正态分布时数据以~_χ±s示;非正态分布参数以中位数及四分位数间距(IQR)表示,参考值范围以95%可信区间(95%CI)表示;计数资料用频数(百分数)表示;正态分布结果比较分析采用双侧独立样本t检验;非正态分布结果比较分析采用Mann-Whitney检验与Kruakal-Wallis检验,P<0.05为有统计学意义。【研究结果】1、52例PIBO患儿(男:女=44:8)及35例健康正常儿童(男:女=18:17)纳入研究,一般情况见表1。PIBO组BALF中以PMN为主,其Median(IQR)、95%CI分别为0.878(0.354)、0.679~0.817。随后是M,其Median(IQR)、95%CI分别为0.038(0.216)、0.082~0.199,EOS及L仅为0.01(0.028)、0.014~0.039;0.020(0.042)、0.030~0.126,PMN比率较M、L、EOS高,差异有显著性(P<0.01);健康正常患儿诱导痰中以M为主,其Median(IQR)、95%CI分别为0.823(0.172)、0.650~0.815,随后是PMN,其Median(IQR)、95%CI分别为0.138(0.185)、0.156~0.320。EOS及L仅为0.003(0.008)、0.002~0.026;0.013(0.012)、0.001~0.0186。M比率较PMN、L、EOS高,差异有显著性(P<0.01);2、PIBO组BALF中PMN比率较健康正常对照组诱导痰中PMN比率明显升高,差异显著(P<0.01),L比率较健康正常对照组明显升高,差异有显著性(P<0.05);PIBO组M比率较健康正常对照组明显降低,差异有显著性(P<0.01)。【研究结论】PIBO患儿气道以中性粒细胞为优势细胞表型。基于此,拟开展后续的研究以验证ANCA是否介导了中性粒细胞炎性反应。第二部分ANCA与中性粒细胞呼吸爆发的相关性我们推测,在PIBO中,ANCA介导中性粒细胞呼吸爆发损伤了气道上皮细胞。但ANCA刺激中性粒呼吸爆发的必要条件尚未清楚,故本研究拟从细胞层面上研究ANCA介导中性粒细胞呼吸爆发的条件,选择鼠来源的ANCA单克隆抗体刺激中性粒细胞,按浓度梯度增加ANCA浓度,探讨中性粒细胞呼吸爆发程度与ANCA刺激浓度及时间的相关性;筛选出ANCA最佳刺激浓度和刺激时间,应用于第三部分的共培养实验。【研究目的】从细胞层面上研究ANCA介导中性粒细胞呼吸爆发的条件,探讨中性粒细胞呼吸爆发程度与ANCA刺激浓度及时间的相关性;筛选出ANCA最佳刺激浓度和呼吸爆发产物MPO最高浓度对应的最佳刺激时间,应用于第三部分实验。【研究方法】1、选择鼠来源的ANCA单克隆抗体(Anti-MPO/Anti-PR3)刺激中性粒细胞,按(0.5μg、1.5μg、2.5μg、5μg)浓度梯度增加ANCA刺激浓度,与阴性对照组(PMN组)及阳性对照组(PMA组)行流式细胞检测,比较三组间荧光强度,确立ANCA刺激中性粒细胞产生呼吸爆发的最佳浓度。2、应用最佳浓度ANCA(Anti-MPO/Anti-PR3)以不同时间段(1h、2h、4h)刺激中性粒细胞,生成产物1、产物2及产物3,检测产物中代表性呼吸爆发脱颗粒产物MPO的水平。【研究结果】1、0.5μgAnti-MPO组及(0.5μg、1.5μg、2.5μg)Anti-PR3组MIF数值较PMN组差异无显著性(P<0.05);1.5μg及2.5μg Anti-MPO组MIF数值较PMN组明显升高,差异有显著性(P<0.05),但较对照组流式图上未见明显峰移。5μg Anti-MPO组及Anti-PR3组较PMN组峰后移近1个数量级,Anti-MPO组与Anti-PR3组MIF的数值分别为(1787.33±198.34)、(1254.33±37.82)均高于PMN组(1050.33±90.01),差异有统计学意义(P<0.05);提示ANCA单克隆抗体(Anti-MPO/Anti-PR3)在一定浓度下才能刺激中性粒细胞呼吸爆发,其中5μg是最佳刺激浓度。2、5μg Anti-MPO以1h、2h、4h的不同时间段刺激中性粒细胞,其呼吸爆发产物1、产物2、产物3中MPO生成量分别为(66.78±2.77)ng/m L、(33.05±7.39)ng/mL、(21.92±4.00)ng/m L较PMN组(25.23±0.93)ng/m L明显增多,差异有显著性(P<0.01),其中1h MPO产生量最多,组间比较均有显著性差异(P<0.05)。【研究结论】1、5μg ANCA(Anti-MPO/Anti-PR3)刺激中性粒细胞可以产生呼吸爆发,为最佳刺激浓度,因已达到实验要求,故不再探索更高浓度;2、Anti-MPO刺激中性粒细胞最佳刺激时间为1h,产生呼吸爆发的代表产物MPO浓度最高;推测在ANCA可介导中性粒细胞呼吸爆发损伤气道上皮细胞进而参与了PIBO的进程。第三部分ANCA刺激中性粒细胞呼吸爆发产物与气道上皮炎性反应的相关性研究本部分研究拟在第二部分体外实验的基础上,构建人中性粒细胞呼吸爆发产物与人小气道上皮细胞共培养体系,予ANCA单克隆刺激中性粒细胞呼吸爆发产物刺激气道上皮细胞,检测上皮细胞IL-6、IL-8炎症指标,探索ANCA刺激中性粒细胞呼吸爆发产物与气道上皮炎性反应的相关性。【研究目的】建立中性粒细胞与气道上皮细胞共培养体系,探讨ANCA刺激中性粒细胞呼吸爆发产物与气道上皮炎性反应的相关性。【研究方法】本研究分9组,分为(1):产物1+气道上皮细胞;(2)产物2+气道上皮细胞;(3)产物3+气道上皮细胞;(4)(TNF+中性粒细胞)+气道上皮细胞;(5)Anti-MPO+气道上皮细胞;(6)TNF+气道上皮细胞;(7)产物1;(8)产物4;(9)PBS+气道上皮细胞(空白对照组)。?至(8)组应用ELISA法检测培养上清液中IL-6及IL-8的水平,分别与(9)组的比较,评估IL-6及IL-8水平的变化。以上实验均重复3次。【研究结果】1、实验各组IL-6水平的检测结果:在9组中以?组IL-6水平最多,为(322.64±103.47)ng/mL,较?组(38.37±36.13)ng/mL、?组(0.75±0.25)ng/mL、(4)组(21.16±15.31)ng/m L、(5)组(12.52±7.23)ng/m L、(7)组(6.76±1.57)ng/m L、(8)组(3.71±3.27)ng/mL、(9)组(1.49±1.49)ng/m L明显升高,有显著差异(P<0.05)。?组IL-6水平较(6)组(114.83±94.03)ng/m L升高,差异无显著性(P>0.05)。2、实验各组IL-8水平的检测结果:在9组中以?组IL-8水平最多,为(246.92±41.94)ng/m L,较?组(44.44±14.95)ng/mL、?组(30.74±2.31)ng/m L、(4)组(32.96±6.12)ng/mL、(5)组(36.30±6.32)ng/mL、(7)组(45.93±4.49)ng/m L、(8)组(35.19±4.49)ng/m L、(9)组(30±6.19)ng/m L明显升高,有显著差异(P<0.05)。?组IL-8水平较(6)组(223.70±44.50)ng/m L升高,差异无显著性(P>0.05)。【研究结论】1、经ANCA(Anti-MPO、Anti-PR3)刺激中性粒细胞的呼吸爆发产物刺激上皮细胞,可以使IL-6及IL-8的分泌增加,造成上皮细胞的炎性损伤。2、ANCA单克隆抗体刺激中性粒细胞呼吸爆发产物与气道上皮共培养,产物浓度越高,气道上皮产生炎症因子IL-6、IL-8水平越高。