应激性早衰是机体遭受各种有害损伤诱发的过早性衰老,如香烟烟雾及阿霉素,它们分别是体内试验和体外实验中最常见的应激性早衰刺激。慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一种衰老性疾病,而肺血管重塑(PVR)是COPD的重要并发症,且与衰老有密切的关系。非瑟酮(Fisetin)是一种黄酮类物质,具有广泛的生物学效应。多项研究证实非瑟酮有抗氧化,抗衰老的作用,能够缓解各种疾病的进程。本实验拟探讨应激性早衰与肺血管重塑的关系,同时研究非瑟酮的抗衰老作用对肺血管重塑的影响。第一部分:探讨应激性早衰与肺血管重塑的关系目的:在相关肺疾病体内实验的研究中,吸烟是引发肺组织应激性早衰的常见原因,应激性早衰的进程中涉及各种分子机制,而早衰必定会发生DNA的损伤。Nrf2/ARE通路通过抑制氧化应激从而保护DNA免受损伤,是目前发现最重要的抗氧化通路。由于香烟刺激可以导致肺血管结构的改变。因此,在本部分实验中探讨应激性早衰与肺血管重塑的关系,及此过程中Nrf2/ARE抗氧化通路的表达情况。方法:筛选年龄相仿且无明显肺功能下降的长期吸烟组及终身未吸烟组的临床标本,两组标本均可见肺小动脉不同程度的肌化,并且长期吸烟组肺小动脉的肌化程度明显高于终身未吸烟组。采用蜡块提取总RNA和QPCR法检测两组肺组织标本抗氧化通路Nrf2/ARE的基因表达情况。另外建立长期吸烟诱发应激性早衰的动物模型,采用Western blot法检测实验大鼠肺组织中衰老相关蛋白P53、P21、P16的表达及抗氧化通路Nrf2/ARE的蛋白表达情况。结果:长期吸烟的动物模型中,吸烟组大鼠较未吸烟组大鼠肺组织中衰老相关蛋白P53、P21、P16的表达明显增高,伴随着抗氧化通路Nrf2/ARE的表达减弱。在人体临床标本的研究中,长期吸烟组肺组织中抗氧化因子Nrf2、NQO-1的表达降低,而HO-1无明显变化。结论:肺血管重塑的发生发展,伴随着应激性早衰和抗氧化通路Nrf2/ARE的表达下降。第二部分:研究非瑟酮的抗衰老效应在肺血管重塑中的作用目的:非瑟酮(Fisetin)是一种黄酮类物质,大量存在于蔬菜和水果中,具有抗氧化、抗衰老等作用。衰老细胞分泌衰老相关分泌表型(SASP),包括炎症因子和细胞生长因子,其中细胞生长因子会促进肺动脉平滑肌细胞的增殖,从而导致肺血管重塑。阿霉素与香烟提取物同属应激性早衰刺激,其比香烟提取物性质更稳定,效果更明显,更广泛的应用于细胞衰老模型的建立。因此,在本部分体外实验中研究非瑟酮抑制阿霉素诱发的应激性早衰在肺血管重塑中的作用。方法:培养人肺动脉内皮细胞(HPAEC)及人肺动脉平滑肌细胞(HPASMC)。采用CCK8法检测不同浓度的Fisetin(5μM、10μM、20μM、30μM、50μM、100μM)对HPAEC增殖的影响。细胞培养后用阿霉素诱发HPAEC衰老,并应用衰老相关的β半乳糖苷酶活性染色,P53/P21及P16的蛋白水平和流式细胞术观察细胞周期等方法验证Fisetin对HPAEC衰老进程的影响。采用Western blot法检测非瑟酮刺激HPAEC后HO-1的表达,Nrf2的核转入情况及P38 MAPK通路的磷酸化表达。应用HO-1瞬时沉默si RNA及P38抑制剂SB 203580分析Fisetin对细胞抗衰老作用的相关分子机制。最后利用HPAEC不同处理组的条件培养基培养人肺动脉平滑肌细胞,并用CCK-8法测量HPASMC的增殖效应。结果:CCK8实验证实,当Fisetin浓度≤20μM时,Fisetin对人肺动脉内皮细胞无明显毒性。此外,衰老相关的β半乳糖苷酶染色实验证实Fisetin减少了阿霉素诱发的衰老染色。流式细胞术检测衰老周期证实,相对阿霉素组的S期百分比,Fisetin预刺激组的S期百分比明显上升。Western blot结果显示,Fisetin抑制了衰老相关蛋白P53/P21及P16的表达。此外,在通路方面,Fisetin促进了P38的磷酸化表达及Nrf2和HO-1的蛋白表达,HO-1瞬时沉默逆转了非瑟酮对细胞的抗衰老作用,同时,P38 MAPK抑制剂SB203580部分消除了非瑟酮诱发的抗衰老作用。最后,相比阿霉素处理组的条件培养基,非瑟酮预处理组的条件培养基减轻了HPASMC的增殖活性。结论:非瑟酮对HPAEC的应激性早衰有保护作用,这种作用通过促进P38 MAPK磷酸化和抗氧化通路Nrf2/HO-1的表达,抑制HPAEC应激性衰老的发生,降低衰老细胞分泌的SASP对HPASMC增殖活性的促进作用,从而缓解肺血管重塑的进程,为以后进一步研究衰老相关的肺血管疾病提供了潜在的参考价值。