背景与目的食管癌是全球最常见的六大恶性肿瘤之一。在我国食管癌的死亡率居恶性肿瘤的第四位(17.38/105)。食管癌早期可无症状或仅有轻微症状,发展到中晚期出现进行性吞咽困难后才能得以临床诊断,失去了治疗的最好时机。在已经对后基因组计划进行研究的今天,从基因水平上筛检食管癌高危易感人群、探究其病因及治疗方案就显得尤为重要。microRNAs (miRNAs)是一类约18-25个核苷酸(nt)长的单链RNA分子。它们可以控制多种基因的表达,介导肿瘤的发生过程,从而发挥癌基因或抑癌基因的作用。为探究miRNA在食管癌中的表达情况,本实验室对食管癌组织及其癌旁组织做了基因芯片分析,发现食管癌组织中miR-429的表达水平明显低于癌旁组织。本研究旨在了解miR-429在食管癌及癌旁组织中的表达情况,探讨其与食管癌患者病理特征的关系；揭示上调miR-429后其对食管癌细胞凋亡及侵袭的影响：初步探索miR-429的生物靶标及其调控机制。方法1.于2011年6月至2012年5月间在郑州大学第一附属医院收集了32例食管癌患者的食管癌组织及其癌旁组织,-80℃保存。采用qRT-PCR方法检测32例食管癌组织及其癌旁组织的miR-429及Bcl-2和SP1基因的mRNA表达水平,通过Western blot实验检测标本中Bcl-2和SP1蛋白的表达水平,分析其表达水平与患者病理临床资料的关系。2.合成miR-429agomir和miR-429negative control,并将其用脂质体转入食管癌细胞EC9706和KYSE30中。根据转染物质的不同将细胞分成三组：miR-429组,转染miR-429agomir; NC组,转染miR-429negative control; Blank组,仅加转染试剂脂质体。转染后的细胞置于二氧化碳培养箱继续培养,用于后续实验。3.对三组食管癌细胞进行CCK-8生长实验,观察miR-429对食管癌细胞增殖的影响。4.对三组食管癌细胞进行流式细胞术和Caspase酶活性实验,观察miR-429对细胞凋亡的影响。5.对三组食管癌细胞进行Transwell实验,观察miR-429对细胞侵袭能力的影响。6.采用[argetScan和miRanda生物信息学分析软件预测miR-429的作用靶标。构建Bcl-2/SP13’UTR区的野生型及突变型重组报告基因载体,分别将其与miR-429agomir或者miR-429negative control共转染入食管癌细胞EC9706和KYSE30中,通过Western blot和双荧光素酶报告实验证实miR-429的作用靶标。7.构建无3’UTR区Bcl-2/SP1的表达载体,单独转入或与miR-429agomir共转染入食管癌细胞EC9706和KYSE30中,通过restore方法分析miR-429调控Bcl-2和SP1表达的作用机制。结果1.食管癌组织中,miR-429的表达水平明显低于癌旁组织(P<0.05), Bcl-2和SP1基因的mRNA和蛋白表达水平明显高于癌旁组织(P<0.05),并且miR-429的表达水平与Bcl-2、SP1基因的表达水平呈负相关。食管癌组织中miR-429、Bcl-2和SP1基因的表达情况均与患者的淋巴结转移情况、分化程度以及TNM分期有关(P<0.05),而与其性别、年龄以及肿瘤位置无关(P>0.05)。2.miR-429组食管癌细胞的miR-429表达水平明显高于NC组和Blank组,差异有统计学意义(P<0.05)。提示转染miR-429后,食管癌细胞的miR-429表达水平上调。3.CCK-8生长实验的结果表明,与NC组和Blank组相比,miR-429组食管癌细胞在第2、3、4和5天时在OD490处的吸光度值均下降,差异有统计学意义(P<0.05)。4.流式细胞术、Caspase酶活性实验结果显示,与NC组和Blank组相比,miR-429组食管癌细胞的凋亡数和Caspase-3/7活性均明显高于NC组和]Blank组的细胞,差异有统计学意义(P<0.05)。5. Transwell实验结果显示,与NC组和Blank组相比,miR-429组穿过基底膜的食管癌细胞数明显减少,差异有统计学意义(P<0.05)。6. Western blot;和双荧光素酶报告实验结果提示,Bcl-2和SPl是miR-429的作用靶标。7. Restore结果提示,miR-429通过作用于Bcl-2和SP1的3’UTR区,负向调控其表达,参与食管癌细胞的凋亡和侵袭。结论1.食管癌组织中的miR-429异常低表达,其表达水平与患者的淋巴结转移情况、分化程度以及TNM分期有关。2.上调miR-429可有效抑制食管癌细胞的生长、侵袭,促进食管癌细胞凋亡。3.miR-429通过作用Bcl-2和SP1的3’UTR区负向调控其表达水平,从而发挥生物学作用。