近年来,市场上近30%的重组蛋白药物是用大肠杆菌生产的。然而,由于大肠杆菌不具备真核生物的部分翻译后修饰、蛋白折叠的部分调控分子等原因,很多真核蛋白在大肠杆菌中表达,往往不能正确折叠而形成不可溶的包涵体,此外,还存在表达量低、表达外源蛋白无活性等问题。对于重组蛋白的高效生产来说,不仅要获得高产的重组蛋白,更重要的是得到高生物活性的分子。目前广泛使用的策略有目的蛋白与分子伴侣等的共表达、与具有助溶作用的蛋白或蛋白标签融合表达等。但是,融合表达可能影响目的蛋白的结构和活性、共表达通常需要多个质粒的共转化等,各自存在一些缺点,因此,开发建立新的外源蛋白在大肠杆菌中的非融合的高效表达系统,具有非常重要的理论和应用价值。在早期研究中,我们发现利用原核系统特有的翻译偶联现象,使用硫氧还蛋白Trx等构建了一系列高效非融合、可溶的表达载体系统pTIG-Trx/MBP/GST等,实现了细胞因子、细菌毒素、单链抗体等七十多种蛋白及其突变体在大肠杆菌中的高效、可溶表达,表明利用翻译偶联实现目的蛋白高效、非融合可溶性表达是一种现实、可行的策略。2011年,Todd H.Tider等通过对宿主抗病毒先天免疫机制等的研究,设计构建了一种广谱抗病毒蛋白RNase L-Apaf (RA),呈现了良好的应用前景,但其在原核系统中表达困难,一定程度上限制了其潜在的临床应用。为了提高广谱抗病毒蛋白RA在大肠杆菌中的表达量,提高蛋白药物的临床应用潜能,本课题利用翻译偶联现象,通过设计标准的转录、翻译调控元件序列以及短的高效表达前导肽序列,设计构建了一种新型非融合高效原核表达系统pTIG-LP,实现了目的蛋白RA在大肠杆菌中表达量的增加,总量约为单独表达的27倍。目的蛋白只有约10%为可溶,严重影响了活性RA的产量,并在后期进行了分析。为了进一步提高RA在大肠杆菌中的可溶性,本课题利用具有广泛助溶活性的SUMO蛋白为辅助蛋白,利用翻译偶联现象,以pET系列载体为基础,构建一种新型非融合可溶原核表达系统pTIG-mSUMO/RA,有效实现了RA在大肠杆菌中表达量和可溶性的同时增加,其蛋白表达总量约为单独表达的2倍,可溶蛋白比例提高到50%,大大提升了其临床应用潜能。总之,本课题通过利用翻译偶联现象,构建了非融合高效原核表达系统pTIG-LP和pTIG-mSUMO等,实现了目的蛋白RA表达量的提高、可溶性的增加,再一次证实利用翻译偶联促进外源真核蛋白在原核系统中的高效可溶性表达方面的独特优势,提出了提高偶联载体稳定性的优化方案。为实现蛋白药物在原核系统中的大规模生产,提供了良好的表达系统,对蛋白药物的大规模生产具有重要应用价值。