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目的有证据表明,micro RNA(miRNA,微小核糖核酸)在各种类型的细胞中是一种与炎症相关的分子。然而,miR-31在脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)刺激的内皮细胞中的表达变化以及这种表达变化对内皮细胞的影响尚不清楚。本研究试图探讨miR-31在LPS刺激培养的肺微血管内皮细胞(human pulmonary microvascular endothelial cells,PMVECs)中调节内皮细胞通透性和炎症的作用机制及信号通路。方法:一、LPS对PMVECs通透性、细胞活力及炎症因子的诱导的影响1.将一系列剂量(0.1 μ g/ml、1 μ g/ml、5 μ g/ml、10 μ g/ml)的 LPS 加入到 PMVECs中。然后收集细胞,并分析细胞通透性指标跨内皮细胞电阻(Transepithelial-endothelial resistance,TER)、异硫酸荧光素标记葡聚糖(fluorescein isothiocyanate,FITC)(mg/ml)与细胞活力(100%)。2.选用5ug/mlLPS加入到PMVECs中,采用Real-time PCR检测血管内皮细胞钙粘连蛋白(VE-Cadherin)、紧密连接蛋白5(Claudin-5)和缝隙连接蛋白43(Connexin-43)mRNA水平;采用ELISA法检测炎症因子肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素 6(interleukin 6,IL-6)、细胞间黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)和血管细胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)水平。二、LPS刺激的PMVECs中microRNA-31表达以及其临床意义1.将一系列剂量(0.1 μ g/ml、1 μ g/ml、5 μ g/ml、10 μ g/ml)的 LPS 加入到 PMVECs后,使用RT-PCR检测miR-31水平。2.转染miR-31过表达载体的PMVECs使用LPS(5 μ g/ml)刺激后,使用Real-time PCR检测miR-31的表达量;分析细胞通透性指标TER与FITC-葡聚糖(mg/ml),采用 Real-time PCR检测VE-Cadherin、Claudin-5mRNA和Connexin-43 mRNA 水平。采用ELISA法检测炎症因子TNF-α、IL-6、ICAM-1和VCAM-1水平。三、磷酸酰肌醇 3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinases,PI3K)/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(serine/threonine kinase,AKT)信号通路参与miR-31在LPS诱导的PMVECs中的作用1.使用 Western Blot 及 qRT-PCR 检测 P-PI3K、PI3K、P-AKT、AKT 的蛋白质表达情况及相对磷酸化蛋白的表达情况。2.PI3K 抑制剂 LY294002抑制PI3K 后,使用 Western Blot 及 qRT-PCR检测PI3K、PI3K、P-AKT、AKT的蛋白质表达情况及相对磷酸化蛋白的表达情况。3.抑制PI3K后采用ELISA法检测炎症因子水平;并分析细胞通透性指标。四、检测ROCK1参与了 miR-31对LPS诱导的PMVECs中的作用1.过表达以及干扰miR-31后,检测HEK293细胞中ROCK1萤光素酶的活性变化。并使用 Western Blot 及 qRT-PCR 检测,转染 miR-31 mimic 和 inhibitor 的 PMVECs中,ROCK1 mRNA和蛋白的相对表达量。2.在LPS刺激的PMVECs中,将ROCK1与miR-31共同过表达,并使用Western Blot检测磷酸化AKT。结果:1.LPS处理后,PMVECs的FITC-葡聚糖(mg/ml)上升,TER和细胞活力(100%)降低,且呈剂量依赖性,在LPS为5 μ g/ml和10 μ g/ml时具有显著性差异(P<0.001);LPS 处理后,VE-Cadherin 和 Claudin-5mRNA 水平降低,Connexin-43 mRNA 水平增加;LPS处理后引起内皮炎症因子增加(P<0.001)。2.miR-31相较于对照组在LPS刺激的PMVECs中被下调,且呈剂量依赖性,在LPS为5ug/ml和10ug/ml时具有显著性差异(P<0.001),差异具有统计学意义。3.miR-31转染的细胞较(LPS+miR-31组)较对照(control)组、LPS组及LPS+NC组,miR-31的表达升高(F=1.755,P<0.001)。miR-31转染的细胞较LPS+NC组,TER升高,FITC-葡聚糖降低;VE-Cadherin和Claudin-5mRNA水平增加,Connexin-43 mRNA水平减少;且PMVECs细胞释放炎症因子的增加较对照组降低。4.LPS组较对照组的PI3K和AKT磷酸化降低(P<0.001);LPS+miR-31组较LPS+阴性对照(NC)组的PI3K和AKT磷酸化增加(P<0.001),差异具有统计学意义。5.抑制PI3K后较LPS+miR-31组的PI3K和AKT磷酸化减少(P<0.01)。说明PI3K/AKT信号通路参与miR-31在LPS诱导的PMVECs中的作用;抑制PI3K后并且炎症因子 IL-6(P<0.01),TNF-α、ICAM-1 和 VCAM-1(P<0.001)水平升高。并且,PMVECs的TER降低,FITC-葡聚糖和细胞活力增加(P<0.01),差异具有统计学意义。6.相较于NC mimic组,miR-31 mimic转染后ROCK1荧光素酶活性降低(P<0.01);相较于NC-inhibitor相,miR-31 inhibitor转染后ROCK1荧光素酶活性升高(P<0.001)。过表达 miR-31 的 PMVECs 中,ROCK1 mRNA 和蛋白下调(P<0.001),而在miR-31沉默的PMVECs中,ROCK1 mRNA和蛋白上调(P<0.001)。7.ROCK1与miR-31共同过表达引起AKT磷酸化表达下调(P<0.001),以及TER降低(P<0.01)和FITC-葡聚糖升高(P<0.001),差异具有统计学意义。结论:1.LPS刺激的PMVECs通透性增加和炎症因子释放增加;并抑制microRNA-31的表达。2.miR-31过表达保护细胞减轻LPS诱导的内皮细胞通透性及炎症增加的作用。3.miR-31过表达可以恢复部分LPS抑制PMVECs中PI3K/AKT磷酸化的作用,PI3K/AKT信号通路参与了 miR-31对内皮细胞的作用。4.ROCK1是miR-31作用的潜在靶点,ROCK1/PI3K/AKT参与miR-31对内皮细胞通透性的保护作用。