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肝脏是维持机体葡萄糖稳定的最重要组织器官,可以通过糖原分解和糖异生两种方式增加葡萄糖的输出、调节血糖稳定。糖异生是指利用乳酸、丙酮酸、甘油、生糖氨基酸等底物生成葡萄糖的过程,肝脏是糖异生的主要场所。病理状态下,肝脏糖异生被过度激活引发高血糖,是导致2型糖尿病(Type 2 diabetes,T2DM)的主要原因。肝脏糖异生除受营养信号和激素水平的调节外,肝脏糖异生关键控制酶的转录活性是调控糖异生水平的关键。因此,揭示肝脏糖异生关键控制酶的转录调控因子,寻找有效抑制肝脏过度糖异生、减少内源性葡萄糖生成的方法,将有望为T2DM临床防治提供新的干预靶标。长链非编码RNA(Long noncoding RNA,lncRNA)是一类长度在200 nt以上无蛋白编码能力的RNA。已证实lncRNA可以在转录前、转录后、表观遗传学等多个层面参与生命活动调控。新近发现lncRNA在调控葡萄糖稳态,参与代谢性疾病如2型糖尿病等的发生中同样起重要调节作用。LncRNA Meg3过表达可显著增加肝脏葡萄糖生成,而肝脏特异性沉默Meg3则有助于恢复糖尿病造成的小鼠葡萄糖代谢损伤;另一条可以被饥饿诱导的lncRNA lncLGR,已被证实可以通过结合异质核糖核蛋白L,抑制葡萄糖激酶活性以及糖原的存储,参与机体葡萄糖代谢调节。鉴于lncRNA数量众多,在肝脏糖代谢研究中的报道依然较少,因此仍有大量功能未知的lncRNA有待于进一步挖掘。第一部分基于高通量测序技术的肝脏糖异生相关lncRNA的筛选我们以“饥饿-再进食”小鼠模型为研究对象,取肝脏组织采用高通量测序技术筛选糖异生相关lncRNA。测序结果显示,在正常饮食组和16h饥饿组共计测得的lncRNA数量分别为28,312和31,947。进一步我们设置:1.与16h饥饿组比在正常饮食组小鼠肝脏表达水平上调3倍以上;2.丰度高、测序读数(Counting reads)>500;3.已被GenBank注释为lncRNA等参数进行筛选。结果显示仅Gm15441,4833411C07Rik,Gm10768和4931408D14Rik符合上述筛选标准。采用定量PCR检测发现,4条lncRNA不仅在受饥饿诱导的小鼠肝脏组织中表达显著上调,而且再进食后表达可以迅速回落到正常水平,但是只有4833411C07Rik和Gm10768高表达于糖异生被过度激活的db/db小鼠肝脏组织中,提示二者可能参与肝脏糖异生调控。因此,进一步我们采用RNAi的方法,沉默二者在原代分离小鼠肝细胞中的表达,明确4833411C07Rik和Gm10768与糖异生调控关系。结果发现,Gm10768沉默后,细胞葡萄糖输出能力显著降低,提示其可能参与肝脏糖异生,而4833411C07Rik无显著影响。因此,我们初步锁定Gm10768作为深入研究的对象。第二部分长链非编码RNA Gm10768在肝脏糖异生中的作用与机制研究我们通过体外和体内实验揭示Gm10768在调控肝脏糖异生中的作用。Gm10768过表达可增强原代小鼠肝细胞葡萄糖生成能力,上调糖异生相关限速酶PEPCK(Phosphoenolpyruvate carboxykinase)和 G6Pase(Glucose-6-phosphatase)表达;在体水平特异性上调肝脏组织中Gm10768表达可激活糖异生,上调小鼠血液葡萄糖和胰岛素水平,降低小鼠葡萄糖耐受性和胰岛素敏感性。Gm10768表达沉默则可以下调原代分离小鼠肝细胞中PEPCK和G6Pase表达,在体水平特异性沉默肝脏组织中Gm10768表达可抑制糖异生,下调小鼠血液葡萄糖和胰岛素水平,增强小鼠葡萄糖耐受性和胰岛素敏感性。此外,在糖尿病db/db小鼠模型中特异性沉默肝脏组织中Gm10768表达,小鼠的高血糖症状、葡萄糖耐受性和胰岛素耐受性均明显得到改善。我们还发现Gm10768的糖异生调控作用可能与miR-214有关,以往研究证实miR-214可以通过调控ATF4(Activating transcription factor 4)表达参与肝脏糖异生。Gm10768可以发挥 ceRNA(Competing endogenous RNA)功能,降低 miR-214 对 ATF4 的抑制作用,上调ATF4表达参与肝脏糖异生调控。