鸭脾坏死病是由鸭正呼肠孤病毒（Duck orthoreovirus,DRV）感染引发的一种新发传染性疾病,该病于2006年在我国首次流行发生。脾脏损伤引发免疫抑制,造成患鸭对其他病原易感性增加,增加了该病的死亡率,在此前的报道中,鸭脾坏死病的死亡率通常为5～15%。2017年起,山东省多地规模化养鸭场发生一种以严重脾脏坏死为特征的传染病,死亡率达到50%,严重危害鸭养殖安全。经鉴定,新型鸭正呼肠孤病毒（Novel duck orthoreovirus,N-DRV）是造成此次新发鸭脾坏死病流行的病原。作为重要的免疫器官,脾脏在免疫应答、病原清除、损伤细胞清除等方面发挥重要作用。病原感染对脾脏的损伤,有助于病毒的复制、传播和疾病的发展。N-DRV感染造成严重的脾脏坏死,但其诱导脾脏损伤的机理尚不明确,而关于N-DRV诱导脾脏细胞损伤机制的相关研究更是处于相对空白的阶段。为了系统的揭示N-DRV诱导脾脏细胞损伤的相关机制,本研究通过开展致病机理研究,首先明确了N-DRV对脾脏等免疫器官的侵袭性,并确定N-DRV主要损伤脾脏巨噬细胞和淋巴细胞,揭示了鸭脾脏坏死灶的产生机理。借助转录组测序技术（RNA-Seq）,筛选获得了细胞损伤相关的差异表达基因并确定了细胞损伤的主要方式,结合荧光探针检测、RNAi等分子生物学技术,验证了铁死亡在N-DRV感染引发的脾脏损伤中的重要作用,并确定了N-DRV诱导巨噬细胞铁死亡的调控机制,为N-DRV乃至其他正呼肠孤病毒诱导细胞损伤机制的研究提供了有效借鉴。研究内容主要分为以下三个方面:1.N-DRV的病原学及致病性研究本研究在临床脾坏死病例中分离获得了三株N-DRV分离株（SDYC、SDLS、XT18株）,并借助高通量测序技术获得了病毒的全基因组序列信息。结合NCBI数据库中的其他水禽源代表性毒株,对序列同源性、遗传进化规律、核酸及氨基酸变异等开展了系统分析。结果表明,N-DRV分离株与DRV分离株（TH11株、091株、HN5d株）之间各基因片段的核苷酸同源性为86.1～99.2%,氨基酸同源性为95.1～100%。三株N-DRV分离株（SDYC、XT18及SDLS株）在λB、λC、μA及σNS编码基因上位于两个分支,提示在该部分基因片段的来源上可能存在差异。全基因组m VISTA可视化分析显示,SDYC株在λB、μA、σA、σNS蛋白编码区与其他水禽源分离株存在显著差异,与经典DRV毒株在σA编码基因存在明显变异。ARV编码蛋白中包含具有不同生物学功能的保守基序,分析发现,N-DRV与经典DRV分离株在λ、μ组蛋白及σA、σB、σNS、p10、p17的功能基序均高度保守,但在σC蛋白氨基酸基序上,与抗原性相关的119～177位氨基酸残基、151～326位的细胞受体结合区域,N-DRV分离株与经典DRV分离株HN5d存在较大变异。蛋白质结构分析方面,SDYC株在λB、μA蛋白上存在多个α螺旋及β折叠结构上的氨基酸变异。1日龄雏鸭经静脉注射感染N-DRV,通过病理学、组织病理学、免疫组化及器官病毒载量观察等,探究N-DRV的致病机理。病理学研究表明,N-DRV对脾脏、胸腺、法氏囊等免疫器官侵袭能力较强。雏鸭脾脏在2 dpi出现肿胀及散在分布的坏死点,感染后5～9 d,脾脏严重坏死,坏死灶占据整个脾脏表面。组织病理学观察结果显示,5 dpi出现局部组织坏死崩解,淋巴细胞减少;7 dpi脾脏组织坏死崩解,淋巴细胞因坏死而大量减少;感染后9～11天,局部坏死组织形成肉芽肿,脾窦扩张,巨噬细胞浸润,至感染后第15天,脾脏坏死区域被纤维组织代替。免疫组化分析显示,脾脏中阳性细胞主要为巨噬细胞和淋巴细胞。TUNEL检测发现,细胞损伤高峰出现在感染后7～9 d,该时段可见大量巨噬细胞凋亡。此外,种鸭的致病性研究结果表明,N-DRV感染能够引起种鸭卵泡萎缩,卵泡膜及输卵管出血,显著降低种蛋受精率和孵化率。以上结果表明,N-DRV是此次新发鸭脾坏死病的病原,N-DRV对脾脏等免疫器官侵袭性强,脾脏损伤细胞主要为巨噬细胞和淋巴细胞,且N-DRV能够经卵垂直传播,危害种源安全。2.N-DRV诱导脾脏细胞损伤机制研究为了探究N-DRV感染后,脾脏细胞基因表达的动态变化,本研究分离了N-DRV感染后1、2、3、5及7天的雏鸭脾脏淋巴细胞,开展转录组学研究。在数据质控合格后,以表达差异倍数|log2Fold Change|＞1,显著性p-value＜0.05为条件筛选差异表达基因,并分别开展GO功能分类和KEGG富集分析。N-DRV感染后的不同时间节点,共筛选出263～658个差异基因,其中上调基因117～492个,下调基因80～349个,差异基因主要涉及免疫系统、细胞生长与坏死、信号转导等生物学功能。在细胞损伤方面,本研究共筛选获得了156个与细胞死亡相关的差异表达基因,主要涉及细胞凋亡、细胞坏死和细胞铁死亡,参与细胞死亡调控的主要为HIF-1、PI3K-Akt、TNF等信号通路。尽管凋亡、坏死和铁死亡均参与了N-DRV诱导的细胞损伤,但差异显著性比较显示,铁死亡在N-DRV诱导的细胞损伤中发挥重要作用。以上研究,明确了N-DRV感染后细胞损伤相关基因的动态变化,提示了铁死亡在脾脏细胞损伤中的重要作用。另一方面,该部分数据也为深入研究禽正呼肠孤病毒感染后细胞损伤及宿主应答反应提供了数据支撑。3.N-DRV诱导巨噬细胞铁死亡的机制研究转录组学研究结果提示,铁死亡在N-DRV感染诱导的脾脏细胞损伤中发挥重要作用。为了确定N-DRV能够诱导的脾脏细胞铁死亡,并进一步明确铁死亡发生机制,本研究选用鸡巨噬细胞HD11开展体外验证。研究发现,N-DRV感染能够诱导HD11细胞产生ROS,且ROS的量与N-DRV的感染剂量和时间呈正相关。感染细胞线粒体出现嵴断裂、嵴数目减少的铁死亡特征性形态学变化,结合感染后,HD11细胞胞内Fe2+浓度升高及铁死亡标记基因蛋白和m RNA水平的差异表达,确认N-DRV感染能够诱导HD11细胞铁死亡。进一步分析转录组学数据发现,铁死亡相关差异表达基因主要定位于铁代谢调节途径（TFRC、TF、ACO1、STEPA3、SLC40A1等）。本研究以转铁蛋白受体TFRC为目的基因,发现RNAi敲低TFRC表达后,显著拮抗了N-DRV感染诱导的胞内Fe2+增多及ROS产生,说明,N-DRV主要通过铁代谢调节途径诱导HD11细胞铁死亡。以上研究证实,N-DRV能够通过铁代谢调节途径诱导巨噬细胞铁死亡,而关于信号转导及铁死亡的最终执行机制则有待于进一步验证。综上,本研究明确了N-DRV对脾脏的损伤机理,发现并验证了铁死亡在N-DRV诱导脾脏损伤中的重要作用,并揭示了N-DRV诱导巨噬细胞铁死亡的具体机制,该项研究填补了家禽领域铁死亡研究的空白,将有助于更深入地了解脾脏损伤及铁死亡调控机制。