研究背景 造血细胞的增殖和分化由一系列的细胞因子及其受体进行精细调控，配体刺激使得细胞因子受体和一系列细胞内分子的酪氨酸残基迅速磷酸化。其中JAKs(Janus kinases)和信号转导与转录活化因子(signal transducers and activators of transcription STATs)在细胞因子受体介导的细胞内信号转导和造血细胞的生长发育过程中起着重要的作用。每条信号途径的正常传递是骨髓生成各系细胞的基础，信号途径的异常可引发多种疾病，如白血病，骨髓增殖性疾病及淋巴增殖性疾病。在过去的十几年中，由细胞因子/生长因子介导的信号转导途径一直是基础研究和应用生物医学研究的热点。迄今对复杂的信号转导过程已有了较系统的认识。转录因子STATs能将由细胞因子/生长因子及其受体相互作用激发的下游信号进行协调与转导，同样酪氨酸激酶JAKs也在信号转导途径中起着重要作用，二者调控着细胞的增殖与分化。许多研究表明STATs的活化可在细胞因子/生长因子刺激后由JAKs或Src家族成员介导。JAKs是一类非受体型酪氨酸激酶，STATs是一类转录因子。当刺激因素如细胞外蛋白与细胞表面受体结合后，几分钟内即可改变胞核内STATs基因表达形式，从而影响细胞生长状态。因此STATs已成为目前信号转导系统研究的热点途径之一。 慢性粒细胞白血病(CML)是源于造血干细胞的恶性克隆性疾病，具有特征性的t(9；22)(q31；q11)染色体异位，产生BCR/ABL融合基因，由该融合基因编码的具有酪氨酸激酶活性的P210蛋白具有很强的致细胞增殖效应。对CML用标准细胞毒性药物的治疗研究已达到平台期，针对引起肿瘤细胞过度增殖的信号途径阻断治疗越来越引起人们的兴趣。STATs参与了多种细胞因子对造血细胞的生长调控，有证据表明STATs信号系统是白血病治疗的重要作用靶。迄今为止特异性的STATs抑制剂尚未被发现，但JAK/STAT信号途径中各种特异的蛋白-蛋白相互作用却是药物干预的潜在作用位点。 动物实验、临床及临床流行病学研究均表明，吲哚美辛具有肯定的抗肿瘤作 中南大学 博士学位论文用［’］。1989年 Brown等［’］报道了吼跺美辛具有抗白血病作用，他们在体外实验中发现吼跺美辛可抑制T细胞白血病细胞株的生长及活力。HICkS L等［‘’］最近发现叼跺美辛能明显抑制急性白血病细胞株OCI／AML－2、OCI／AML－5、NB－4的增殖。而且有一组特殊的NSAtoS包括呗跺美辛、舒林酸、托美丁、阿西美辛、佐美酸、甲芬那酸在非毒性水平可明显增加化疗药物如恿环类抗生素（阿霉素、表阿霉素）以及替尼泊贰、依托泊贰、长春新碱的细胞毒作用，该协同效应为浓度依赖性，且不依赖于NSAIDS对环氧化酶活性的抑制，尤其是对多药耐药基因过度表达的HL60／ADR和 CORL23R细胞株I’‘］。M肌。RDI‘’］曾报道非毒性浓度的蚓跺美辛能提高VP－16对K562细胞的敏感性，以及氨甲蝶吟对LLC细胞（Lewis肺癌细胞株）的敏感性。 我们先前的研究表明叼跺美辛（IN）可以诱导 CML细胞及 K562细胞株凋亡，C朋p踞卜3、CSSp8SC－8的表达上调和裂解激活是咽跺美辛诱导出62细胞凋亡的重要机制，叼跺美辛诱导的K562细胞凋亡不依赖于COX活性抑制。本课题以间跺美辛作用于K562细胞株及CML病人骨髓白血病细胞，并以具有促进增殖分化作用的GM－CSF及W：N－口作为阳性对照，探讨叼跺美辛作用于CML细胞对JAK／STAT信号转导途径的影响，进一步揭示叼跺美辛抗慢粒白血病细胞增殖效应的分子机制。第一部分 蚓跺美辛抑制dL细胞增殖与JAI。、STAT；、STAT。 蛋白质表达 目的：观察吼跺美辛对CML细胞的增殖抑制效应、对JAK》SM；、STAT。蛋白表达水平的影响及其亚细胞定位，确定GM－CSF或IFN－口与IN联合应用在对抑制CML细胞增殖方面是否有协同效应。 方法：台盘蓝拒染法活细胞计数、MTT试验检测细胞的增殖活力；Western印迹检测JAKZS J 蛋白质表达；间接免疫荧光技术观察STATI、STATS在CML细胞中的定位。 2 中南大学 博士学位论文 结果：Wes比n印迹分析显示随着哨睬美辛浓度增高，细胞增殖受抑，STAT卜STAT蛋白表达水平呈叼跺美辛浓度和时间依赖性下调；而GM－CSF、IFN．a干预使 STATI、STATS表达水平上调；叼跺美辛、IFN－口干预对爪 表达无明显影响；GM－CSF使JAK。表达上调。GM－CSF或WN－口与IN联合作用后对STATI、STAT的表达无协同效应。间接免疫荧光技术显示STATI、STATS呈散点状分布于胞浆中，并呈IN浓度依从性表达抑制。 结论：STATI、STATS蛋白表达抑制可能是咽跺美辛抑制CML细胞增殖的分子基础。GM－CSF。IFN－Q与IN联合对STATI、STATS的表达不产生协同效应。第二部分 闯跺美辛抑制eL细胞槽殖与STAT信号途径活 化（磷酸化）的抑制 目的：揭示叼跺美辛作用CML细胞后STAT信号途径的活化是否发生变化，以及STAT的下游作用靶BCIX。蛋白表达的改?