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帕金森病（Parkinson’s disease,PD）是常见的神经退行性疾病之一,发生率仅次于阿尔兹海默症,其主要的临床表现为震颤、肢体僵直、行动迟缓等。随着我国人口逐渐趋于老龄化,PD发病率呈逐年上升趋势,严重威胁着人们的生命健康和生活质量。临床上针对PD的主要治疗手段是以直接或间接补充多巴胺的拟多巴胺药物治疗及一些侵入性的开颅手术,但治疗效果并不理想。雷帕霉素（Rapamycin,RPM）是一种自噬诱导剂,其可以通过mTOR依赖途径激活自噬从而保护神经细胞内环境稳态,有利于改善PD症状。血脑屏障（blood-brain barrier,BBB）是限制所有脑部疾病治疗的关键要素,其阻断了 98%的小分子药物和几乎100%的大分子药物进入脑组织,从而造成脑部疾病难治疗、效果差的局面。因此,如何克服BBB,实现药物的靶向富集提升药物疗效,是帕金森病治疗中亟待解决的主要科学问题。随着纳米技术的兴起,大量纳米药物载体的制备引起研究者们的兴趣。外泌体（Exosoms,EXO）是由多种细胞可以分泌产生的一种天然内源性药物载体,具有生物相容性好、能够克服潜在生理屏障等优势,尤其是血液外泌体所展现的脑部靶向潜能得到了研究者们的广泛关注。然而,EXO携载药物跨越BBB的效率及其对病灶部位的靶向性仍存在很大局限。为了进一步提升EXO的靶向性能,研究者们曾采用化学合成或基因工程改造的方法对其进行修饰,但耗时耗力,并且也无法避免脱靶效应。大量研究表明聚焦超声（Focused ultrasound,FUS）联合微泡能够可逆开放BBB,具有可控操作的靶向性、安全性高、毒副作用小等优点,近期已被FDA批准用于脑部疾病的治疗与诊断。基于以上研究背景,本研究拟开发一种非侵入性、生物相容性好的天然载药递送系统:首先使用FUS安全可逆开放BBB,在开放窗口注射携载RPM的血液外泌体（EXO-RPM）,促使RPM精准递送并富集至脑部病变区域;其次,利用RPM上调细胞自噬活性促进α-突触核蛋白（α-synuclein,α-syn）降解,减少α-syn蛋白的病理性积聚,达到保护多巴胺能神经元的目的;然后,从行为学指标和组织切片观察评估该系统对PD治疗的有效性、可行性及生物学机制,为探索PD诊疗新途径提供研究基础。论文主要从EXO-RPM的制备与特性分析、EXO-RPM对MPTP诱导的SH-SY5Y细胞PD模型的保护作用研究、超声促进EXO向脑部的靶向递送、FUS联合EXO-RPM对MPTP诱导的小鼠PD模型的保护作用四个方面展开。第一部分EXO-RPM的制备与特性分析通过优化提取步骤,采用超速离心法提取血液外泌体,将其作为雷帕霉素的药物载体;采用温和孵育的药物载入方法对雷帕霉素进行包载,进一步优化EXO-RPM的制备工艺和载药比例,得到稳定性较佳的EXO-RPM,并对其理化性质和生理特征进行表征与鉴定。使用纳米颗粒跟踪分析系统测定外泌体的粒径与电位分布;利用透射电子显微镜观察其超微形态结构;采用蛋白免疫印迹技术对外泌体标志性蛋白CD63、CD9和转铁蛋白受体（transferrin receptor,TfR）的表达进行鉴定。结果表明,所制备的EXO-RPM分散均匀,形态规则,粒径与电位分布适中,稳定性良好,几种EXO标志性蛋白均有表达,与文献报道相符,具有纳米药物载体的优良性质,可供后续研究使用。第二部分EXO-RPM对MPTP诱导的SH-SY5Y细胞PD模型的保护作用研究通过激光共聚焦显微镜和流式细胞仪检测细胞对外泌体的摄取情况及其在细胞内的亚细胞定位;使用CCK8法对药物浓度、孵育时间进行筛选,为后期细胞自噬应答机制分析提供基础;观察药物处理后细胞活性变化,验证EXO-RPM是否对模型细胞有保护作用;同时观察细胞自噬蛋白水平与α-syn蛋白表达变化,为后续的PD小鼠的治疗研究提供依据。研究结果表明SH-SY5Y细胞对EXO的摄取具有时间依赖性,且EXO分布于细胞质基质中,EXO-RPM可在体外上调胞内自噬水平,降解α-syn蛋白,提示该载药系统可能对PD神经性损伤有一定的保护作用。第三部分超声促进EXO向脑部的靶向递送体外建立BBB模型,探究超声可促进外泌体穿过BBB;体内观察聚焦超声联合微泡开放小鼠BBB的作用参数和可逆程度,为后期给药选择最佳时间窗口;通过小动物活体成像仪器研究不同处理后EXO在小鼠体内分布趋势,尤其是脑区外泌体的富集情况。研究结果表明,聚焦超声联合微泡开放BBB,具有一定的安全性、可逆性,超声可以瞬时提升EXO穿越BBB的效率,且可以促进EXO-RPM靶向至脑区PD病灶部位,提示超声联合EXO的载药递送系统可提高药物入脑并提升PD治疗效率。第四部分FUS联合EXO-RPM对MPTP诱导的PD模型小鼠的保护作用研究通过旷场实验、旋转棒测试考察小鼠的行为能力变化,通过高效液相色谱法检测小鼠纹状体内多巴胺（Dopamine,DA）的含量,评估PD小鼠治疗效果;通过组织切片研究小鼠脑内酪氨酸激酶（Tyrosine Hydroxylase,TH）的活性和α-syn蛋白表达变化及透射电子显微镜观察自噬水平,检验FUS联合EXO-RPM对PD小鼠模型的治疗效果;并通过监测小鼠的体重变化、血清生化指标进行评估,结合不同处理组小鼠的脑、心、肝、脾、肺、肾等组织病理差异,初步评估该治疗模式的安全性。研究结果显示:治疗后PD模型小鼠的行为障碍在很大程度上被恢复,脑内DA与TH水平发生逆转,自噬水平发生上调,α-syn蛋白降解增强,说明FUS联合EXO-RPM的处理模式保护了 MPTP诱导的PD模型小鼠脑内受损神经元并改善了小鼠的运动能力,该治疗模式相对安全有效。结论本研究成功设计并开发了一种将聚焦超声与载雷帕霉素的血液外泌体进行联合的内源性纳米递送系统,通过细胞分子生物学、动物行为学等技术对PD体内外模型的治疗效果展开了相关研究。结果显示,FUS联合EXO-RPM的处理模式在体内和体外均具有良好的治疗效果,这种处理模式可能成为具有应用潜能的帕金森病治疗新模式,有望为未来临床治疗提供新的思路与方向。