急性心肌梗死（AMI）可导致心肌损伤后心肌纤维化和形态学改变,如左心室功能受损、左心室重构和心脏扩大。尽管随着急诊经皮冠状动脉介入治疗（PCI）和溶栓治疗的广泛实施,AMI治疗的成功率不断提高,但40%的患者出现左心室重构,14.2%的患者出现心力衰竭。心肌纤维化引起的心力衰竭和心律失常严重威胁着人类的生命和健康。一旦发生病理性重塑,就很难逆转。然而,目前仍没有针对心肌重塑过程根本原因的特异性治疗方法。因此,探究AMI后心肌纤维化的病理机制,对于寻找灵敏且高效的早期诊断标记物,研发靶向治疗药物,改善患者预后具有重要的临床意义。最近的研究表明,一些非编码RNAs（ncRNAs）,如microRNA（miRNAs）和lncRNAs,可以作为基因调控网络中的调控分子。LncRNAs在心脏病中的调控作用近年来受到越来越多的关注。LncRNAs在控制心肌肥厚、心脏同种异体移植排斥、缺血性心力衰竭等心脏疾病发生中的关键作用已被初步阐明。而其中的 Zinc finger Antisense 1（Zinc finger antisense 1,lncRNA-ZFAS1,ZFAS1）为锌脂蛋白编码基因Znfx1的反义链,有研究证实了它有调控心血管系统的功能,是一种潜在的急性心肌梗死的诊断标志物,亦有学者研究发现ZFAS1是预防和治疗MI的潜在功能靶点,但ZFAS1在MI中的功能作用还需要进一步阐明。Wnt/β-catenin信号通路在大多数生理和病理过程中发挥着关键作用,包括组织和器官形成、细胞内稳态的维持、伤后修复和再生以及疾病进展。近期研究表明,肾、肺、肝、心、皮肤纤维化的发生和进展与Wnt/β-catenin信号通路的异常激活密切相关。MI后,Wnt信号通路的持续和过度激活会导致严重的心肌纤维化,损害心肌功能。研究表明,抑制Wnt信号通路可以防止胶原沉积并改善MI后的心脏功能。已有研究报道,多种lncRNAs参与Wnt/β-catenin信号通路的激活,lncZFAS1是否参与调控Wnt/β-catenin信号轴有待证实。基于以上背景,我们提出如下科学假说:心肌纤维化是心肌梗死后心功能不全的关键诱因。而这一心肌负性重构受lncZFAS1介导的Wnt/β-catenin信号通路的调控。沉默LncZFAS1能够抑制Wnt/β-catenin信号通路,进而抑制心肌成纤维细胞的增殖、迁移和侵袭,进一步防止胶原沉积,从而改善心肌梗死大鼠的心功能。为验证以上假说,本研究首先探讨了 lncZFAS1的表达水平与AMI后心肌纤维化程度和心功能改变的相关性,同时验证了 Wnt/β-catenin信号通路的过度激活在心肌重构中的调节机制,其次,采用慢病毒转染技术和通路抑制剂干预,通过体内外水平实验,明确了 lncZFAS1对Wnt/β-catenin信号通路的调控作用。本研究有助于为心肌梗死的预防和治疗提供新思路。第一部分:LncRNA ZFAS1与AMI后心肌纤维化的相关性目的:LncRNAZFAS1参与心血管疾病的发生发展过程。本部分研究拟探讨LncRNA ZFAS1在体内和体外心肌纤维化模型中的表达情况。方法:通过冠状动脉左前降支结扎术建立AMI诱导的大鼠心肌纤维化模型;分离大鼠原代CFs细胞,并通过缺氧处理建立体外心肌纤维化模型;在动物实验中,超声心动图测定并记录大鼠左室放血分数（LVEF）和左室短轴缩短率（LVFS）;HE染色观察心肌组织病理学变化;Masson染色评估胶原堆积状况,计算胶原沉积强度反应心肌梗死率;免疫组化技术检测心肌组织中vWF水平以评价血管生成的变化;RT-qPCR技术检测大鼠心肌组织中LncRNAZFAS1的表达水平。在细胞实验中,采用MTT法检测细胞增殖能力;通过Transwell和Wound healing实验技术测定细胞的侵袭和迁移能力;利用RT-qPCR技术测定CFs细胞中LncRNAZFAS1的表达水平。结果:1.与对照组相比,AMI组大鼠的LVEF和LVFS明显下降。2.AMI大鼠组心肌缺血坏死区域细胞排列出现异常,组织间隙扩大,且胶原堆积量明显增加,心肌梗死发生率也明显增高,血管新生分子标志物vWF的表达明显下调。3.AMI大鼠心肌组织中LncRNAZFAS1的表达水平显著增加。4.缺氧处理后,CFs细胞增殖能力明显提高,细胞的侵袭和迁移水平显著增加。5.缺氧处理后,CFs细胞中LncRNAZFAS1表达明显上调。结论:1.AMI大鼠的心功能受损,心肌组织发生纤维化。2.LncRNAZFAS1在AMI大鼠纤维化动物模型以及缺氧处理诱导的体外心肌纤维化模型中表达上调。第二部分:沉默LncRNA ZFAS1缓解AMI大鼠心肌纤维化并抑制心肌成纤维细胞活化目的:本部分研究拟在体内外验证沉默LncRNAZFAS1对AMI大鼠心肌纤维化进程的改变以及对CFs细胞活化水平的影响。方法:通过冠状动脉左前降支结扎术建立AMI诱导的大鼠心肌纤维化模型;分离大鼠原代CFs细胞,并通过缺氧处理,建立体外心肌纤维化模型。AMI大鼠尾静脉注射LncRNA ZFAS1的慢病毒敲低载体（shZFAS1）,CFs细胞经慢病毒转染敲低LncRNA ZFAS1（shZFAS1）。在体外,超声心动图测定并记录大鼠LVEF和LVFS;HE和Masson染色评价心肌组织病理学变化和心肌梗死率;免疫组化检测心肌组织中vWF水平以评价血管生成的变化;RT-qPCR检测大鼠心肌组织中LncRNAZFAS1的表达水平。在体外,MTT法检测细胞增殖能力;Transwell和Wound healing测定细胞的侵袭和迁移能力;RT-qPCR测定CFs细胞中LncRNAZFAS1的表达水平。结果:1.沉默LncRNA ZFAS1显著提升了 AMI大鼠的LVEF和LVFS。2.沉默LncRNAZFAS1可明显缓解AMI大鼠的症状,降低心肌梗死率,促进vWF的表达。3.沉默LncRNA ZFAS1可明显逆转缺氧处理对CFs的影响,表现为抑制CFs的增殖、迁移和侵袭能力。结论:1.沉默LncRNA ZFAS1可以改善AMI大鼠心功能,抑制AMI大鼠心肌纤维化。2.沉默LncRNAZFAS1可抑制CFs细胞活化。第三部分:LncRNAZFASl通过调节Wnt/β-catenin信号通路参与调控心肌纤维化的机制研究目的:Wnt/β-catenin信号通路的异常激活参与了 AMI后心肌纤维化的发生机制,LncRNAZFAS1对Wnt/β-catenin信号轴的调节作用有待确证。本部分研究拟深入探讨LncRNAZFAS1是否通过靶向Wnt/β-catenin信号通路影响AMI大鼠心肌纤维化及CFs细胞活化。方法:通过冠状动脉左前降支结扎术建立AMI诱导的大鼠心肌纤维化模型;分离大鼠原代CFs细胞,并通过缺氧处理,建立体外心肌纤维化模型。使用LncRNA ZFAS1慢病毒敲低载体（shZFAS1）分别转染细胞和动物,同时给予Wnt/β-catenin通路激活剂HLY78进行干预。在体外,超声心动图测定并记录大鼠LVEF和LVFS;HE和Masson染色评价心肌组织病理学变化和心肌梗死率;免疫组化检测心肌组织中vWF水平以评价血管生成的变化;RT-qPCR和Western blot检测大鼠心肌组织中β-catenin和GSK-3β的mRNA和蛋白表达水平。在体外,MTT法检测细胞增殖能力;Transwell和Wound healing测定细胞的侵袭和迁移能力;RT-qPCR 和 Western blot检测CFs 细胞中β-catenin 和 GSK-3β 的 mRNA和蛋白表达水平。结果:1.大鼠AMI模型和缺氧处理CFs细胞模型中,β-catenin表达显著增加,GSK-3β表达显著降低,而LncRNAZFAS1基因下调能够明显逆转上述趋势。2.沉默LncRNAZFAS1可以显著逆转AMI组大鼠LVEF和LVFS的下降趋势,而同时给予Wnt/β-catenin通路激活剂HLY78后,LVEF和LVFS明显下降。3.沉默LncRNAZFAS1可明显缓解AMI大鼠的症状,逆转心肌组织病理改变,降低心肌梗死率,促进vWF的表达,HLY78共同处理后,与AMI+shZFAS1组相比,梗死率明显升高,vWF表达显著下降。4.缺氧处理后CFs细胞的增殖,迁移和侵袭受到明显促进,而同时给予shZFAS1可明显逆转缺氧对CFs的影响,抑制CFs的增殖、迁移和侵袭能力,但Wnt/β-catenin通路激活剂HLY78共同干预较shZFAS1单独预处理又会明显促进CFs的增殖,迁移和侵袭。结论:1.Wnt/β-catenin信号通路在AMI大鼠纤维化动物模型以及缺氧处理诱导的体外心肌纤维化模型中表达上调。2.沉默LncRNAZFAS1可以抑制Wnt/β-catenin信号通路。3.沉默LncRNAZFAS1可以通过抑制Wnt/β-catenin信号通路,缓解AMI后心肌纤维化,并抑制CFs细胞活化。