背景:人类牙齿是由高等钙化组织构成的器官,也是人体最坚硬的组织。牙齿组织因其不易受环境与理化因素的影响,是人体抵抗极端条件的作用、保存时间最长的器官。因此,这种稳定性使牙齿能够作为一种特殊的用于法医DNA分型的生物性检材来源,成为法医学鉴定的极具价值的生物学物证。以往的碎尸、溺死高度腐败、火灾及其它严重破坏型尸体的法医学鉴定中,其中重要的涉及个人识别方面的鉴定,由于其它来源的人体生物性检材的严重破坏,使得难以从常规生物性检材中（生物源性斑迹及人体软组织等）进行DNA分型,这样,具有保存特性的骨及牙齿组织就显示出其潜在的应用性。牙齿作为具有这种保存特性的生物性检材用于DNA遗传标记的分析目前主要依靠完整牙齿的牙髓和其硬组织部分研磨制成的牙粉,对于较为陈旧性的检材,通常难以获得可供分析的牙髓;坚硬的牙本质制成的粉末也存在检出效率低的问题。此外,对于活体组织如果拟采用牙齿进行DNA分析的情况下,上述样本将很难获取。龋齿是一种细菌性疾病,从结构上破坏了牙釉质和牙本质,而且牙髓也可能因龋坏而坏死。然而,正是这些细菌的作用,会导致牙齿的结构发生一定程度的改变,也使受损牙齿产生了被腐蚀后形成的产物,这样就提供了一种可能的替代物,可对其进行分子水平的分析。在法医学领域中,目前采用龋齿作为检材进行法医学鉴定,无论是针对人源性标记,还是靶向细菌种类标记进行个人识别均鲜有报道。在牙科学领域中,选择龋齿组织作为DNA的主要来源,对龋齿的病理生理方面进行探讨及积累的数据也极为有限。因此,基于龋齿组织进行DNA水平分析,不仅对于法医学鉴定中的应用有其特殊的意义,而且也将为后续牙科学领域龋齿的相关研究提供有价值的基础数据。目的:建立从人龋齿组织中高效提取DNA的方法;选择人非编码区STR遗传标记,对龋齿中提取的DNA进行分型鉴定,探讨其检测效能、稳定性及法医学应用的潜在价值;对mtDNA高变区进行测序分型检测,并验证提取的龋齿DNA拷贝数对STR分型的影响;为龋齿的病理生理学的分子学水平研究提供基础数据。方法:收集2016-2018年期间在中国医科大学附属口腔医院就诊患者的龋齿120颗。其中,龋周手术切割组共有37位女性和23位男性,年龄范围为15-68岁;牙齿颈部切割组共有42位女性和18位男性,年龄范围为17-64岁。所有患者均签署了知情同意书,本研究也获得了中国医科大学伦理审查委员会批准。专业口腔外科医生在严格的无菌条件下拔除牙齿,并储存在消毒纱布中,直到进行下一步处理。纳入标准是视诊或影像学诊断为龋齿,排除标准是根管治疗的牙齿、牙根内吸收、根尖周病变和严重的根管口开放的牙齿。对牙齿进行温和漂白,刮除全部软组织,然后在-20°C条件下保存,直到使用。根据国际龋病检测和评估系统（ICDAS）分类、影像学检查以及是否存在软龋或硬龋,由熟练的牙医收集龋齿样本。龋齿样本DNA提取前的处理,首先应用生理盐水将表层碎屑和菌斑清洗两次,然后,对两组龋齿样本分别不同方法进行DNA提取前处理:a)龋周手术切割组:共计60颗牙齿,其中40颗磨牙、11颗前磨牙、9颗切牙,用无菌金刚砂钻在硬龋周围切割,用不同尺寸的无菌挖匙挖取软化龋坏牙本质。将收集到的硬、软牙本质龋碎片分别保存在微离心管中进行分析。在采集到坚硬的龋齿釉质的地方,需要对少数样本进行粉碎。b)牙齿颈部切割组:共计60颗牙齿,其中45颗磨牙、7颗前磨牙、8颗切牙。在龋齿颈部水平用碳化钨钻头切割,便于直接接触牙髓。使用不同型号的牙髓K锉从髓腔、根管和根尖收集牙髓组织样本（图3）。龋齿样本的基因组DNA提取,研究中将采集的约6-20mg样品置于微离心管中,应用Tiangen和Qiagen两种不同的生物组织DNA提取试剂盒,经适当的改进部分操作步骤后,对龋齿样本进行基因组DNA的抽提。提取后的龋齿基因组DNA经DANO Drop2000定性及定量后,调整至合适的浓度用于常染色体及mtDNA遗传标记的扩增。常染色体DNA遗传标记的检测,研究采用Goldenye20A系统对获得的龋齿样本DNA进行基于荧光的多重扩增,扩增的遗传标记包括1个性别位点和19个常染色体STR,其中包括13个联合DNA指数系统（CODIS）和6个其他位点。对获得分型结果进行评估的方法为:1)全谱,为可对所有19个STR基因座和釉原蛋白基因准确分型;2)部分谱,为可对10个以上STR基因座和釉原蛋白基因准确分型;3)低谱,为可对10个以下STR基因座和釉原蛋白基因准确分型;4)无谱,为未检测到STR基因座的分型,无论是否能鉴定出釉原蛋白基因。mtDNA遗传标记的检测,研究选取了12份低谱和部分谱STR结果的样本,扩增了其mtDNA高变区I和II,采用Sanger测序法对扩增产物进行直接测序,依据修改的剑桥序列分析测序结果。结果:龋周手术对龋病组织的取样是保守的,可以安全地收集龋病组织,而颈部切割术允许进入根管并取样牙髓组织。经适当改良提取方法后,在两组龋齿样本中成功提取到基因组DNA,但提取的核酸显示出较大程度的质量差异。经对120份龋齿样本中提取DNA的常染色体STR分型后,结果显示共有118份（98%）样本获得了可用于法医鉴定的遗传图谱。其中,全谱样本为?（）;部分谱样本为?（）;低谱样本为?（）;无谱样本为?（）。为了进一步探讨龋齿样本中提取的DNA用于遗传标记检测的能力,研究对来源于两个不同组别中的3个低谱和3个部分谱STR分型结果样本进行了mtDNA高变区I和II的测序,结果显示所有测序样本均可以得到清晰的图谱,与对应的参考序列比对后,所有样本线粒体DNA的HV1和HV2分型结果均准确无误。结论:1.人的龋齿缺损表面上的龋坏组织可以有效地提取到基因组DNA。2.龋齿样本中提取的DNA可以用于常染色体DNA遗传标记STR的分型,作为一种潜在的替代手段可以应用于法医学的个人识别鉴定中。3.龋齿样本中提取的DNA可以用于mtDNA中遗传标记的分析,特别是对于常染色体STR分型不全的样本更具意义。