目的:恶性肿瘤的药物治疗面临两大棘手挑战,其一,药物剂量过低和治疗时间过短导致治疗效果不理想;其二,大多数化疗药物没有靶向性,对机体有很大的毒副作用,很多病人并非死于恶性肿瘤,而是死于治疗过程中药物所致的组织器官损伤。肝脏是机体重要的解毒和药物代谢器官,化疗药物很容易直接或间接损伤肝脏。故如何在化疗过程中减轻肝脏损伤值得高度关注。不同的化疗药物作用机理不同,造成的损伤也不一致。研究证明,大多数化疗药物都可引起肝损伤,如中毒性肝炎、肝纤维化、肝细胞坏死、肝细胞脂肪变性等。在临床上化疗导致重度肝损伤必须立即停用可疑药物,对于轻度肝损伤,则需要减少化疗药物用量,缩短用药时间,并配合使用抗炎、抗氧化、解毒、降酶、退黄等护肝药物进行辅助治疗。5-氟尿嘧啶（5-Fluorouracil,5-FU）是嘧啶核苷酸合成抑制剂,在肝脏经二氢嘧啶脱氢酶代谢,能抑制胸苷酸合成酶,从而干扰DNA和RNA合成,属于抗代谢类化疗药。5-FU具有良好的抗肿瘤作用,同时对机体也有严重的毒副作用,但迄今对肝脏的毒副作用尚不明确。因此,深入探讨5-FU对肝脏的毒副作用不仅对阐释其药理作用有重要的理论意义,而且对寻找临床防治化疗所致肝脏损伤的保护方法也具有指导价值。当归是中医临床“补血、活血”的经典药物,已有数千年的应用历史。研究表明,当归具有多种药理学功能,包括抗肿瘤、抗血栓、抗氧化、抗辐射、抗炎、抗菌、增强免疫功能等。当归多糖（Angelica polysaccharide,ASP）是当归的重要药物活性成分,研究报道,ASP既能促进骨髓造血功能,有“补血”功效;也能抑制白血病细胞增殖,并促进其向成熟方向分化,有“祛邪”功效,可见ASP有“扶正祛邪”的双向调控作用。我们前期研究证实,ASP能减轻5-FU对骨髓基质细胞损伤,进而减轻骨髓造血细胞损伤,延缓细胞早衰。我们的最新研究表明,ASP逆转5-FU诱导的细胞成骨/成脂分化失衡与ASP的抗氧化作用密切相关。但ASP的抗氧化作用是否可以在肿瘤治疗中减轻5-FU对肝脏的损伤值得深入研究。最新氧化损伤理论认为,转录因子Nrf2介导的抗氧化通路异常是导致氧化应激损伤的关键环节。本文以小鼠肝脏及人正常肝细胞系MIHA为研究对象,通过构建体内动物与体外细胞模型,研究ASP调控Nrf2/HO-1信号通路减轻5-FU所致肝脏损伤的作用。本研究旨在为阐释祖国医学的“补血、活血理论”及“扶正祛邪理论”,为现代抗氧化学说提供新的理论依据;为ASP用于防治化疗药物导致的肝脏损伤提供实验室依据;为减轻5-FU所致肝脏毒性提供有效的天然保护剂,并为治疗肝脏损伤提供新的靶点。方法:1.肝脏与肝细胞形态学相关指标检测HE染色观察肝脏组织结构改变;TUNEL染色法检测肝脏细胞凋亡;PAS染色检测肝脏糖原;SA-β-gal染色检测肝细胞衰老;Masson染色法分析肝脏纤维化改变;油红O染色法检测肝细胞脂质沉积;透射电镜观察肝细胞超微结构。2.肝脏与肝细胞功能学相关指标检测酶学法测定血清及肝脏组织丙氨酸氨基转移酶（ALT）及天门冬氨酸氨基转氨酶（AST）含量;微板法测定肝脏组织甘油三酯（TG）及胆固醇（TC）含量;活性氧（ROS）染色法检测肝脏组织中ROS含量,DCFH-DA法检测MIHA细胞中ROS含量;相应试剂盒检测肝脏组织超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）的活性及一氧化氮（NO）、丙二醛（MDA）的含量。3.肝脏与肝细胞损伤机理相关指标检测RT-qPCR法分析脂质合成代谢相关基因（Sirt1、Scd1、Ppargc1a、PPAR-γ、PPAR-α、Pnpla2、Mlxipl、Mgat1、Ldlr、G6PC、Foxo1、Fgf21、Dgat2、Dgat1、Cpt1a、Cd36、AMPK及Acadl）表达;RT-qPCR法分析内质网应激相关基因（XBP1、PERK、IRE1α、GRP78、e IF2α、CREB1、CHOP、ATF4及ATF6）表达;Western blot法分析Bcl-2、Bax、Keap1及HO-1蛋白水平;免疫组化法测定Keap1蛋白水平;免疫荧光法检测8-OHd G与HO-1蛋白水平;Western blot法与免疫荧光法检测Nrf2蛋白的核转位情况。结果:1.肝脏与肝细胞形态学指标检测结果1)肝脏大体形态学指标:5-FU组小鼠肝脏颜色暗黄,且外观较油腻,肝脏重量较对照组明显降低,差异有统计学意义（P＜0.01）。ASP+5-FU组小鼠肝脏颜色较红,肝重较5-FU组明显增高（P＜0.05）,提示ASP可减轻5-FU所致小鼠肝脏重量降低。2)肝脏组织形态学指标:对照组与ASP组小鼠肝脏组织无异常,肝细胞排列整齐有序,5-FU组肝细胞排列紊乱,细胞空泡化及肿胀明显（P＜0.001）。与5-FU组相比,ASP+5-FU组小鼠肝组织损伤较轻,肝细胞排列整齐有序,细胞无明显空泡化及肿胀（P＜0.001）。3)肝脏纤维化指标:与对照组相比,5-FU组肝脏组织中胶原纤维明显增多（P＜0.001）。与5-FU组相比,ASP+5-FU组肝脏组织中胶原纤维明显减少（P＜0.001）。4)肝脏组织糖原含量指标:与对照组相比,5-FU组肝脏组织糖原含量明显减少（P＜0.001）。与5-FU组相比,ASP+5-FU组肝脏组织糖原含量明显增加（P＜0.05）。5)肝脏组织及MIHA细胞脂滴含量指标:与对照组相比,5-FU组肝脏组织及MIHA细胞脂滴均明显增多（P＜0.001）。与5-FU组相比,ASP+5-FU组肝脏组织及MIHA细胞脂滴均明显减少（P＜0.001）。6)肝脏衰老细胞检测指标:SA-β-gal染色结果显示,各组的肝脏衰老细胞数量差异均无统计学意义。7)肝脏组织凋亡细胞检测指标:TUNEL染色结果表明,与对照组相比,5-FU组肝脏组织中凋亡细胞明显增多（P＜0.001）。与5-FU组相比,ASP+5-FU组的肝脏组织中凋亡细胞明显减少（P＜0.001）。8)肝脏组织与MIHA细胞超微结构观察指标:透射电镜结果表明,5-FU组肝脏组织肝细胞线粒体肿胀,且细胞内大量脂滴沉积,细胞核体积变小、核固缩。ASP+5-FU组肝脏组织细胞线粒体肿胀减轻,细胞内未见明显的脂滴沉积,细胞核异常不明显;5-FU组MIHA细胞内线粒体与内质网肿胀明显,且含有大量的脂滴。ASP+5-FU组MIHA细胞内线粒体与内质网肿胀不明显,未见明显的脂滴沉积。2.肝脏与肝细胞功能学指标检测结果1)肝脏组织与血清中ALT及AST检测结果:与对照组相比,5-FU组小鼠血清及肝脏组织的ALT和AST含量均明显升高（P＜0.01）。与5-FU组相比,ASP+5-FU组小鼠血清及肝脏组织的ALT和AST的含量均明显降低,差异均有统计学意义。2)肝脏组织TC及TG检测结果:与对照组相比,5-FU组肝脏组织TC含量无明显变化。但5-FU组小鼠肝脏组织中TG含量显著升高（P＜0.001）。与5-FU组相比,ASP+5-FU组的TG含量显著降低（P＜0.001）。3)肝脏组织与MIHA细胞ROS检测结果:与对照组相比,5-FU组小鼠肝脏组织及MIHA细胞ROS含量均明显增加（P＜0.001）。与5-FU组相比,ASP+5-FU组小鼠肝脏组织及MIHA细胞ROS含量均明显降低（P＜0.001）。4)肝脏组织抗氧化物检测结果:与对照组相比,5-FU组肝脏组织中SOD及CAT的活性明显降低（P＜0.05）。与5-FU组相比,ASP+5-FU组的SOD及CAT的活性明显升高（P＜0.05）。5)肝脏组织脂质过氧化物检测结果:5-FU组肝脏组织中MDA和NO含量明显升高（P＜0.001）。与5-FU组相比,ASP+5-FU组肝脏组织中MDA和NO含量明显降低（P＜0.001）。3.肝脏与肝细胞损伤机理指标检测结果1)肝脏组织与MIHA细胞凋亡相关蛋白检测结果:Western blot结果显示:与对照组相比,5-FU组小鼠的肝脏组织与MIHA细胞中促凋亡蛋白Bax的水平明显升高,而抗凋亡蛋白Bcl-2的水平显著降低。与5-FU组相比,ASP+5-FU组小鼠的肝脏组织与MIHA细胞中促凋亡蛋白Bax的水平明显降低,抗凋亡蛋白Bcl-2的水平显著升高,上述差异均有统计学意义。2)肝脏组织与MIHA细胞脂质合成代谢相关基因检测结果:RT-qPCR结果表明:与对照组相比,5-FU组小鼠的肝脏组织中PPAR-γ、CD36和Fgf21的表达显著增加,Ppargc1a、Mlxipl、G6pc、Foxo1、Pnpla2、AMPK、Acadl、Cpt1a、Mgat1和PPAR-α的表达明显降低（P＜0.05）。而Sirt1、Scd1、Dgat1、Dgat2和Ldlr的表达差异无统计学意义。与对照组相比,5-FU组MIHA细胞中CPT1A、FOXO1、PPARGC1A、PPAR-α、PNPLA2、Acadl、AMPK、G6PC、Mgat1和Mlxipl的表达显著降低;CD36、Fgf21和PPAR-γ的表达显著增加。与5-FU组相比,ASP+5-FU组MIHA细胞中CPT1A、FOXO1、PPARGC1A、PPAR-α、PNPLA2、Acadl、AMPK、G6PC、Mgat1和Mlxipl的表达显著升高,差异均有统计学意义;CD36、Fgf21和PPAR-γ的表达显著降低,差异均有统计学意义。3)MIHA细胞内质网应激相关基因检测结果:RT-qPCR结果表明:与对照组相比,5-FU组小鼠MIHA细胞中与内质网应激相关基因中PERK、GRP78、e IF2α和CREB1的表达明显增加,差异均有统计学意义。与5-FU组相比,ASP+5-FU组MIHA细胞中CREB1,CHOP和ATF4的表达明显降低（P＜0.05）,其余基因表达差异无统计学意义。4)MIHA细胞DNA损伤相关蛋白标志物8-OHd G检测结果:免疫荧光结果显示:与对照组相比,5-FU组MIHA细胞DNA损伤标志物8-OHd G含量明显升高（P＜0.001）。与5-FU组相比,ASP+5-FU组MIHA细胞8-OHd G含量明显降低（P＜0.001）。5)肝脏组织与MIHA细胞Nrf2/HO-1信号通路相关蛋白检测结果:小鼠肝脏组织:免疫荧光结果显示,与对照组相比,5-FU组细胞核中Nrf2水平明显降低（P＜0.001）。与5-FU组相比,ASP+5-FU组细胞核中Nrf2水平明显增加（P＜0.05）。Western blot检测结果与免疫荧光结果吻合。免疫组化结果显示:与对照组相比,5-FU组Keap1蛋白水平明显升高（P＜0.01）;与5-FU组相比,ASP+5-FU组Keap1蛋白水平明显降低,差异有统计学意义。免疫荧光结果提示,与对照组相比,5-FU组HO-1蛋白水平明显降低（P＜0.001）。与5-FU组相比,ASP+5-FU组HO-1蛋白水平明显升高（P＜0.001）。Western blot检测结果与上述结果吻合。MIHA细胞:免疫荧光与Western blot结果显示,与对照组相比,5-FU组细胞质中Nrf2水平明显升高,细胞核中Nrf2水平显著降低（P＜0.001）。与5-FU组相比,ASP+5-FU组细胞核中Nrf2水平明显升高,但细胞质中Nrf2水平明显降低（P＜0.001）。Western blot结果显示:与对照组相比,5-FU组Keap1蛋白水平明显升高（P＜0.001）,与5-FU组相比,ASP+5-FU组Keap1蛋白水平明显降低（P＜0.001）;与对照组相比,5-FU组HO-1蛋白水平明显降低（P＜0.05）。与5-FU组相比,ASP+5-FU组HO-1蛋白水平明显升高（P＜0.001）,免疫荧光检测结果与上述结果吻合。结论:1.5-FU会导致肝脏组织和肝细胞结构及功能损伤,可用于肝损伤模型构建及其防治机理研究。2.ASP能减轻5-FU所致肝脏组织和肝细胞结构与功能损伤,可用作化疗时对肝脏的保护剂。3.ASP减轻5-FU所致肝脏损伤可能与激活Nrf2/HO-1信号通路密切相关。