论文部分内容阅读
目的:考察通窍活血汤(TQHXD)含药脑脊液对谷氨酸损伤的PC12细胞的保护作用及部分作用机制,为该方的临床应用提供依据。方法:1、采用大脑中动脉阻塞法(MCAO)建立局灶性脑缺血损伤大鼠模型,灌胃通窍活血汤于MCAO大鼠,制备含通窍活血汤的大鼠脑脊液。3、在研究通窍活血汤含药脑脊液对谷氨酸(GLU)损伤的PC12细胞的保护作用中,设定3个浓度空白脑脊液对照组(细胞培养液+5%空白脑脊液、细胞培养液+10%空白脑脊液、细胞培养液+20%空白脑脊液),3个浓度空白脑脊液模型组(细胞培养液+5%空白脑脊液+GLU、细胞培养液+10%空白脑脊液+GLU、细胞培养液+20%空白脑脊液+GLU),3个浓度的含TQHXD脑脊液组(细胞培养液+5%含药脑脊液+GLU、细胞培养液+10%含药脑脊液+GLU、细胞培养液+20%含药脑脊液+GLU)。考察指标包括光学显微镜观察细胞形态学变化;MTT法检测细胞的增殖活性;台盼蓝染色、AO/EB染色、LDH检测三个指标考察细胞膜通透性的改变;通过试剂盒检测细胞内NO、SOD、MDA的浓度、DCFH-DA荧光探针染色法检测细胞内ROS的浓度,考察PC12细胞内氧化应激水平;通过试剂盒检测ATP酶活力水平,罗丹明123染色的方法考察细胞内线粒体跨膜电位的改变间接考察细胞能量代谢变化;通过Fura-2/AM染色法检测PC12细胞内游离钙浓度水平,考察不同浓度含药脑脊液对细胞内钙离子浓度的变化;Westen-blotting法检测各组Bcl-2、Bax表达。结果:1.MTT实验果表明,在谷氨酸浓度为20mmol/L时,PC12细胞存活率约为50%。梯度空白脑脊液实验筛选时,空白脑脊液浓度在0%~20%范围内对PC12细胞生长有明显增值作用,而在40%的增值作用有轻微下降,故本实验浓度组设为5%、10%、20%。2.光镜观察模型组细胞形态,TQHXD组细胞类似神经突起的细胞轴突易见的细胞比例明显多于模型组,细胞间联系任较多,细胞漂浮明显降低,具折光性细胞明显增加;MTT实验果表明,模型组OD值小于对照组,且有有显著性差异;TQHXD组OD值明显大于模型组。台盼蓝染色结果,对照组细胞极少数被染色,模型组与TQHXD组均有不同程度细胞被染色,TQHXD组染色比率明显小于模型组;经AO/EB染色后,模型组可被EB染色的细胞比例明显高于对照组,而TQHXD组的染色情况优于模型组。LDH检测结果显示,模型组细胞上清液中LDH浓度明显高于对照组,而TQHXD组含药脑脊液的保护作用使得LDH浓度显著低于模型组。3.通过试剂盒检测细胞内NO、MDA、SOD、ATP酶活性,结果显示模型组的NO及MDA高于对照组和TQHXD组,SOD及ATP酶活性则较低;各组细胞经DCFH-DA染色后,检测结果表明模型组的ROS水平较对照组和TQHXD组显著升高,而罗丹明123染色后荧光强度比降低,表明线粒体膜电位降低,尤其是显强荧光的细胞数目较少;经Fura-2/AM染色后检测细胞内游离钙离子检测结果显示,模型组的钙离子浓度升高;Westen-blotting法检测细胞Bax/Bcl-2比值,实验结果表明,对照组和TQHXD组比模型组有显著性降低。结论:1.本实验中谷氨酸造模浓度为20mmol/L,实验中使用的低中高含药脑脊液浓度为5%,10%,20。2.通窍活血汤含药脑脊液中的有效成分可改善谷氨酸损伤的PC12细胞膜的通透性,而发挥保护作用。3.通窍活血汤含药脑脊液中的有效成分通过降低细胞中NO、MDA的合成,增强SOD活力,加强细胞自身清除自由基的能力抵抗PC12细胞的氧化损伤作用。通过提高ATPase活力、稳定线粒体的正常功能,维持细胞的能量代谢,同时减轻细胞内钙离子超载程度,抑制凋亡蛋白的表达,抑制神经兴奋毒性级联反应的进一步发展。