杀粉蝶菌素A1(Piericidin A1)是可以由多种链霉菌产生的α-吡啶酮类天然产物。杀粉蝶菌素A1作为一种线粒体呼吸作用抑制剂,通过竞争性结合,抑制复合体I中Fe-S簇的氧化和泛醌的还原,从而阻断生物体的呼吸作用。基于这一原理,杀粉蝶菌素A1显示出了良好的生物活性,主要表现在对致病真菌,蚕,菜青虫等。来自票霉素链霉菌杭州湾变种(Streptomyces piomogeues var.Hangzhouwanensis)的杀粉蝶菌素A1生物合成基因簇已经被克隆。核心结构α-吡啶酮的生物合成机制已经得到初步解析,但后修饰基因pieB1、pieB2和pieE,以及调控基因pieR的功能仍然不清楚。本研究在分析杀粉蝶菌素A1生物合成途径基础上,利用体内基因置换、基因回补,以及体外生化实验对杀粉蝶菌素A1生物合成基因簇中的两个后修饰基因pieB1和pieB2的功能进行研究。为获得活性更好、毒性更小的杀粉蝶菌素衍生物建立了基础。在获得甲基转移酶基因pieB2基因缺失突变株,初步确定其与杀粉蝶菌素A1生物合成相关基础上,研究了杀粉蝶菌素A1产生菌中甲基转移酶基因pieB2的功能。首先利用接合转移的方法构建pieB2回补菌株ZZY-1。发酵结果显示,对应pieB2基因缺失突变株LQ-9不再产生杀粉蝶菌素a1,而是积累了一种脱甲基产物,回补菌株zzy-1恢复了杀粉蝶菌素a1的产生。通过hplc和lc-ms,以及nmr分析确定了此产物的化学结构。然后,通过高保真pcr克隆pieb2基因到表达载体pet28a上,构建质粒pjtu5997,转化入大肠杆菌e.colibl21(de3)/plyse中诱导表达。n-末端融合组氨酸标签的pieb2在大肠杆菌中获得可溶性表达,利用高效液相色谱检测了pieb2的体外酶活,通过体外催化实验证明了甲基转移酶pieb2的功能。随后,对杀粉蝶菌素a1产生菌生物合成基因簇中另一个甲基转移酶基因pieb1的功能进行了研究。发酵结果显示,该突变株lq-8不再产生杀粉蝶菌素a1,而是积累了一种中间产物,通过hplc和lc-ms分析,以及核磁共振nmr鉴定了此产物的化学结构。通过高保真pcr克隆pieb1基因到表达载体pet28a上,构建质粒pjtu5995,转化入大肠杆菌e.colibl21(de3)/plyse中诱导表达,但是没有获得可溶性表达蛋白,无法通过体外催化证明了pieb1甲基转移酶的功能。于是,对pied基因缺失突变株lq-5进行喂养,喂养从pieb1基因突变株发酵积累的产物,结果恢复了杀粉蝶菌素a1的产生,从而验证了pieb1基因缺失突变株发酵积累的中间产物,是由pieb1基因缺失导致而不是代谢支路产物,也间接表明pieb1作为甲基转移酶参与了杀粉蝶菌素a1的生物合成。最后,对杀粉蝶菌素a1生物合成基因簇中调节基因pier进行基因缺失,成功获得基因缺失突变株。发酵结果显示,该突变株产生杀粉蝶菌素A1的能力下降,证明pieR在杀粉蝶菌素A1的生物合成中起到正调控作用。