研究背景：自体游离毛发移植术已成为临床治疗毛发缺损特别是雄激素性秃发最常用的手术方法,但存在许多问题,如供区不足、供区瘢痕、移植密度低,移植成活率低,明显影响手术效果,毛囊组织工程的研究成为了解决这些问题的关键。毛囊中各类细胞的分离是整个毛囊组织工程研究的基础,毛囊是由上皮成分(包括毛母质、内外根鞘)和真皮成分(包括毛乳头、结缔组织鞘)组成的,其中毛乳头细胞是构成毛乳头的主要间质细胞,它们是一簇特化的成纤维细胞。所有的毛乳头细胞在外观上都呈成纤维细胞样,而且在含有小牛血清的培养基中培养的毛乳头细胞有着聚集性生长的特性。随着毛囊的周期性循环,毛乳头的形态也发生着周期性的改变。它在毛囊的生长发育形成及周期调控中起着重要的作用。因此建立毛乳头细胞体外培养模型,对于详尽地了解毛乳头细胞体外培养生长特点,以及如何诱导毛囊的发生,具有重要的意义。毛囊中的上皮成分是毛发纤维产生的基础,对于毛囊组织工程的构建是必不可少的种子细胞,目前的实验主要是以动物触须毛囊和人头皮毛囊为研究材料,分离毛囊中各类细胞。但目前对于这两类细胞的分离方法也只适用于实验室的少量制备,不适合于组织工程对细胞分离的大规模高效快速的要求。目前已经成功建立了多种毛囊重建的实验动物模型,但对于影响毛囊重建方向的因素还未见相关研究报道。目的：(1)研究小鼠皮肤毛囊细胞的分离方法。(2)研究表皮细胞、毛囊细胞、移植部位对毛囊重建的影响。(3)研究可降解支架材料对毛囊重建的影响。(4)研究毛囊重建方向的决定因素。方法：(1)小鼠皮肤毛囊细胞的分离培养与鉴定方法取3～5d C57BL/6J近交系乳鼠5只,置无菌培养皿中,安尔碘消毒3遍,PBS充分冲洗,转移至另一无菌培养皿中,剪下背部全层皮肤,平铺于培养皿中,加入0.2% Dispase,充分浸没组织块,置37℃水浴消化2h,倒掉消化液,用镊子小心提起全层皮肤平铺于另一干燥的无菌培养皿中,真皮面朝上,把真皮从表皮上剥离,表皮行常规石蜡切片HE染色。PBS冲洗真皮,用剪刀修剪成小块,取一小块行常规石蜡切片H&E染色,其余置离心管中,在37℃缓慢搅拌的条件下加入0.2%Ⅰ型胶原酶消化30分钟,加入适量完全培养基稀释消化液,充分振荡,经250μm筛网(60 TYLER MESH)过滤后收集滤液,150g离5分钟,收集沉淀重悬于完全培养基,20g离心3分钟,重复2次,沉淀再次重悬于适量完全培养基,加等量9% Ficoll。在15ml锥形离心管中加入5ml 9% Ficoll,再缓慢加入10ml上述制备的沉淀-Ficoll混悬液(约含8～10只乳鼠真皮消化物),40g离心5分钟,去上清液。沉淀重悬于完全培养基,40g离心5分钟,重复3次,收集沉淀加入适量0.2%Ⅰ型胶原酶置37℃水浴消化1h,用吸管间断吹打,消化完毕,加PBS稀释消化液,450g离心5分钟,去消化液,再加入0.125%胰蛋白酶37℃水浴消化10分钟,加入完全培养基,充分振荡,经25μm筛网(500 TYLER MESH)过滤后收集滤液,450g离心5分钟,重复3次,收集细胞备用。调整细胞浓度为1×106个／ml,台盼蓝染色法检测细胞存活率,行流式细胞仪检测CD34、CD117表达。细胞沉淀重悬于完全培养基,调整细胞浓度1×105个／ml。取1 ml细胞悬液接种于35mm培养皿(预先把清洁无菌的盖玻片平铺于皿底),置培养箱1h,去掉培养基,重新加入新鲜培养基置5% CO2培养箱中培养。24h更换一次培养液。细胞生长至80%融合时进行传代培养。小心吸出旧培养液,用PBS清洗(冲洗)3次,加入适量0.125%胰蛋白酶,使消化液的量能盖住细胞,倒置显微镜下观察消化细胞,若多数细胞出现胞质回缩,细胞之间不再连接成片,弃去胰蛋白酶液,加入新鲜的培养液。用吸管将已经消化细胞吹打成细胞悬液,置10ml离心管中,500g离心5min,弃上清液,重复离心洗剂2次,弃去清液,加入2ml培养液,用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液,按1：2进行传代培养。对原代培养细胞及传代培养细胞按试剂盒操作说明行α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)和碱性磷酸酶(ALP)染色鉴定。(2)毛囊细胞注射移植方法取3～5d C57BL/6J近交系乳鼠5只,置无菌培养皿中,安尔碘消毒3遍,PBS充分冲洗,转移至另一无菌培养皿中,剪下背部全层皮肤,平铺于培养皿中,加入0.2% Dispase,充分浸没组织块,置37℃水浴消化2h,倒掉消化液,用镊子小心提起全层皮肤平铺于另一干燥的无菌培养皿中,真皮面朝上,把真皮从表皮上剥离备用。在含表皮的培养皿中加入适量0.125%胰蛋白酶室温消化10分钟,用吸管间断吹打,使表皮细胞充分游离,加入适量完全培养基。消化液经25μm筛网(500 TYLER MESH)过滤后收集滤液,450g离心5分钟,重复3次,收集细胞备用。取10mg Dil置离心管中,加入5ml DMSO,避光,37℃水浴,间断振荡至充分溶解,无菌过滤分装至PCR反应管中,每管10μl,-20℃冻存。调整表皮细胞浓度为1×107个／ml,取1ml细胞悬液置离心管中,加入10μl DiI储存液,吸管吹打混匀。置5%CO2培养箱中标记30分钟。450g离心5分钟,弃上清,重悬于完全培养基中,重复上述离心过程3次以去掉多余的荧光探针。重悬于完全培养基中备用。按同样浓度对毛囊细胞行DiO标记。取表皮细胞(1×107个)+毛囊细胞(1×107个)制成1ml细胞悬液,在裸鼠背部标记5个点,用1ml注射器行皮内注射,形成一小水泡,按住进针点出针。每点注射0.1ml,每点注射细胞数目为1×106个。按同样注射方法行表皮细胞(1×106个)、毛囊细胞(1×106个)、毛囊细胞(1×105个)、毛囊细胞(1×104个)、毛囊细胞(1×103个)、1代培养毛囊细胞(1×106个)、2代培养毛囊细胞(1×106个)、3代毛囊细胞(1×106个)、表皮细胞(1×106个)+大鼠足底成纤维细胞(1×106个)注射。3周后取材行冷冻切片荧光检测和石蜡切片HE染色。按上述同样注射方法,行毛囊细胞(1×106个)皮内注射,分别在在2d、4d、1周、3周、6周后取材行冷冻切片荧光检测和石蜡切片HE染色。毛囊细胞(1×107个)制成1ml细胞悬液,在裸鼠背部标记5个点,用20ml注射器针头穿刺至筋膜,用移液器吸取0.1ml细胞悬液沿穿刺点平行插入皮下,把细胞注射在筋膜表面,每点注射0.1ml。3周后取材行冷冻切片荧光检测和石蜡切片HE染色。。(3)毛囊细胞与材料的复合移植方法把Ⅰ型胶原海绵置无菌培养皿中,修剪成1×lcm大小。调整毛囊细胞浓度为1×107个／ml,每块胶原海绵滴加0.1ml细胞悬液。取裸鼠3只,腹腔注射戊巴比妥钠0.4ml/100g(10mg/ml),麻醉成功后,安尔碘消毒背皮肤3遍,在头部和尾部分别切开长约1cm切口,深达筋膜,将胶原海绵置入皮下,缝合切口。4W取材行石蜡切片HE染色。取PLGA微管,剪成长1.5cm小段,浸75%酒精消毒1h,PBS冲洗3遍,浸PBS过夜备用。取裸鼠3只,腹腔注射戊巴比妥钠0.4ml／100g(10mg/ml),麻醉成功后,安尔碘消毒背皮肤3遍,在头部和尾部分别切开长约0.5cm切口,深达筋膜,将PLGA微管插入皮下。调整毛囊细胞浓度为1×107个／ml,在每个微管中注入细胞悬液0.1ml。缝合切口。4w取材行石蜡切片HE染色。Ⅰ型胶原海绵、PLGA微管直接装台镀膜进行扫描。毛囊细胞与Ⅰ型胶原海绵复合培养1w后,弃培养液,加入PBS清洗3遍,经固定、干燥行扫描电镜检测。(4)毛囊细胞小室移植方法毛囊细胞开放小室移植取5ml耐高温的塑料离心管,去掉中央部分,在盖子下端贴一层透明胶带,固定后在胶带中央扎数个小孔,高压消毒备用。取5只裸鼠,腹腔注射戊巴比妥钠0.4ml/100g(10mg/ml),麻醉成功后,安尔碘消毒背皮肤3遍,在背部切除一加圆形皮肤,深达筋膜,直径为离心管盖直径的一半。把制备好的离心管盖子插入皮下,盖子下端朝向皮肤表面,暴露于空气中,把皮肤缝合在盖子周边固定,形成一个可以容纳细胞悬液的开放小室。调整毛囊细胞浓度为1×107个／ml,在每个小室内注入细胞悬液0.1ml。同时行单独小室移植作为对照组。4w取材行石蜡切片HE染色和冷冻切片荧光检测。毛囊细胞封闭小室移植取5ml耐高温的塑料离心管,去掉中央部分,高压消毒备用。取5只裸鼠,腹腔注射戊巴比妥钠0.4ml/100g(10mg/ml),麻醉成功后,安尔碘消毒背皮肤3遍,在背部切开全层皮肤,切口长度为离心管盖直径的一半,深达筋膜,把制备好的离心管盖子完全插入皮下,使皮肤完全覆盖整个盖子,切口缝合固定,形成一个可以容纳细胞悬液的皮下封闭小室。调整毛囊细胞浓度为1×107个／ml,在每个小室内注入细胞悬液0.1ml。4w取材行石蜡切片HE染色和冷冻切片荧光检测。结果：(1)小鼠皮肤毛囊细胞的分离培养与鉴定结果C57BL／6J乳鼠出生后3d皮肤毛囊大多已经发育完整,5d时多数毛干已经穿出皮肤表面。经Dispase消化后,表皮极易从真皮上剥离,组织切片可见真皮含有大量毛囊,结构完整,毛囊与周围组织间隙变得疏松,真皮与表皮交界部位未见表皮成份残留。真皮消化液经过滤、低速离心、密度梯度离心后可收集大量毛囊及毛囊组织块,经胶原酶、胰蛋白酶消化后可获得毛囊单细胞悬液,细胞存活率在85%以上。流式细胞仪检测表明,分离的毛囊细胞中含有2.5% CD34阳性细胞,8.3%CD117阳性细胞。原代培养细胞呈现自发聚集性生长特性,随着传代次数增加,聚集性生长特性逐渐消失。3代以后不再呈现聚集性生长特性。聚集性生长区细胞呈ALP阳性,周围细胞有少量阳性表达,随传代次数增加ALP阳性细胞数逐渐减少,4代以后的细胞无ALP阳性表达。所有培养的细胞均呈α-SMA阳性,表达稳定,不随传代次数增加而变化。(2)毛囊细胞注射移植结果表皮细胞皮内注射移植组3周后所有注射点外观稍隆起,形成一个内含灰白色内容物的囊,冷冻切片荧光检测见皮内少量红色荧光,组织切片HE染色无可见的毛囊结构。足底成纤维细胞皮内注射移植组3周后所有注射点均无外观可见的变化,冷冻切片荧光检测见皮内密集绿色荧光,组织切片HE染色无可见的毛囊结构。表皮细胞+足底成纤维细胞皮内注射移植组3周后所有注射点外观稍隆起,形成一个内含灰白色内容物的囊,冷冻切片荧光检测,见皮内以绿色荧光为主,散在分布少量红色荧光,组织切片HE染色无可见的毛囊结构。毛囊细胞皮内注射移植后2d,组织切片HE染色见移植区形成一个皮内囊,囊壁较厚,由大量长梭形成纤维样细胞构成,囊内含有大量圆形、椭圆形细胞,核大、胞质不明显,囊内同时可见大量均质红染无细胞成份。囊内侧壁见大量细胞密集排列,散在分布排列稀疏的细胞团,细胞外基质明显增多,中央见均质红染的角化物,局部可见腺样细胞。冷冻切片荧光检测见囊内呈密集的绿色荧光,囊壁呈稀疏的散在分布的绿色荧光。移植后4d,注射部位轻微隆起,外表呈灰色,镜下可见大量再生的毛囊,毛球部呈黑色,无明显毛干。移植后1周,注射点均可见明显隆起,外表呈现黑色,镜下可见大量毛囊伴有明显的黑色毛干,局部见密集分布的血管,管径增粗。移植后3周注射部位形成一个含有灰白色内容物的囊肿,镜下可见密集的黑色毛发,冷冻切片荧光检测见明亮绿色荧光。整个组织块行石蜡切片HE染色,见囊壁较薄,结构完整,外壁为致密的纤维组织,有粗大的血管穿行,内衬有类似表皮的角化上皮样结构,囊内含有大量均质红染无细胞成份,新生毛囊朝向中心,毛球部朝向外侧,有些毛囊周围可见排列有序的腺样细胞,类似皮脂腺样结构。移植后6周,见囊内充满大量毛干,镜下可见大量脱落的杵状毛干及处于生期的毛囊。表皮细胞和毛囊细胞的复合皮内注射移植后3周,注射部位形成一个含有灰白色内容物的囊肿,镜下可见密集的毛发,石蜡切片HE染色结果同毛囊细胞单独皮内注射移植。冷冻切片荧光检测,见囊内容物以绿色荧光为主,散在分布少量红色荧光。新生毛囊呈绿色荧光,毛乳头部位最为明显。当毛囊细胞浓度1×106个／ml时,即每个注射点含细胞数1×105个,再生毛囊的数量急剧减少,当毛囊细胞浓度低于1×106个／ml时,注射部位只会形成一个灰白色囊肿,但无新生毛囊形成。经快速贴壁培养的1代、2代、3代毛囊细胞细胞皮内注射移植后均无新生毛囊形成。毛囊细胞皮下注射移植3周后,见皮下散乱分布大小不等的灰白色囊肿,新生毛囊数量少,方向杂乱。(3)毛囊细胞与材料的复合移植结果扫描电镜可见PLGA微管内径1.5mm,管壁厚lmm。管壁中含大量连通的微孔,直径10-50um。Ⅰ型胶原海绵材料孔径较粗,直径100-500um,与毛囊细胞复合培养1w后可见有少量细胞贴壁生长。PLGA降解检测表明,4w时开始出现材料降解,可见有血管长入。毛囊细胞与Ⅰ型胶原海绵复合移植4w,组织取材行石蜡切片HE染色,可见少量新生毛囊结构形成,毛干不明显,方向杂乱,冷冻切片呈明亮绿色荧光。毛囊细胞与PLGA微管复合移植4w,见微管开始降解,管腔塌陷,表面有新生血管长入,但未见新生毛囊。(4)毛囊细胞小室移植结果小室单独行开放创面移植1w,见创面收缩明显,小室边缘已经开始脱离皮肤,去除小室后3w,见直径1cm的圆形创面收缩至直径2mm。在小室中加入毛囊细胞,开放创面移植后1w,见创面无明显收缩,小室中央见淡红色半透明组织形成,局部可见黑色沉积物。4w后小室周边创面已愈合,创面无收缩,表面见大量新生黑色毛发垂直于皮肤表面生长。石蜡切片HE染色见皮肤结构发育完整,表皮、真皮层次清晰,绝大多数毛囊均垂直于皮肤表面生长,毛囊上、中1／3交界处可见皮脂腺,但未见立毛肌结构。冷冻切片荧光检测,见毛发生长区的表皮及毛囊均呈明亮的绿色荧光,毛囊周围的组织无明显荧光。毛囊细胞封闭小室移植4w,打开小室,底面可见新生毛囊平行于皮肤表面生长,方向排列杂乱,伴有大量新生血管。冷冻切片荧光检测,见毛囊及周围组织均呈明亮的绿色荧光。结论(1)本研究首次采用小鼠皮肤制备了毛囊单细胞悬液。其细胞成份主要为毛乳头细胞,含有2.5% CD34阳性的毛囊干细胞,8.3%CD117阳性的黑色素细胞。(2)本研究中所分离的毛囊细胞裸鼠皮内注射能够重新进行发育,形成大量结构完整的正常毛囊和皮脂腺。这种毛囊的再生依赖于所移植细胞的密切接触。(3)Ⅰ型胶原海绵和PLGA微管不支持毛囊细胞的定向重建。(4)毛囊的发育空间为再生毛囊的定向提供了可能性,而气液界面则决定了最终新生毛囊的方向。毛囊细胞开放小室移植可以实现新生毛囊的正常体表分布,构建结构、功能完整的皮肤组织,与注射移植法相比,更具有临床应用的前景。