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免疫系统在宿主抵御微生物和病原体入侵的过程中具有至关重要的作用。而免疫系统功能的紊乱会导致机体产生炎症、感染甚至癌症。因此,寻找低毒、无副作用的天然活性物质来增强机体的免疫力对健康至关重要。研究发现硫酸化多糖具免疫调节功能,能够刺激免疫系统或控制免疫细胞的活性来发挥免疫调节作用,是一种具有潜在价值的用于临床免疫系统疾病治疗辅助药物的生物活性物质。青钱柳多糖(Cyclocarya paliurus polysaccharide,CP)作为青钱柳的主要活性成分之一,具有多种生物活性。而硫酸化修饰作为一种提高青钱柳多糖生物活性的有效方法,可以提高青钱柳多糖的抗氧化、抗炎和抗肿瘤等生物活性。目前,关于硫酸化青钱柳多糖的免疫调节活性多为单一方面的体内或体外研究,免疫调节作用机制也不明确。因此,本论文通过氯磺酸-吡啶法制备硫酸化青钱柳多糖(Sulfated Cyclocarya paliurus polysaccharide,SCP3),以巨噬细胞RAW264.7为细胞模型,环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠为动物模型,从体内、体外全面研究SCP3的免疫调节活性及分子机制,并从肠道菌群和代谢物等多个角度分析SCP3的免疫调节作用机制。论文主要研究内容与结果如下:(1)通过氯磺酸-吡啶法(氯磺酸:吡啶,v/v,1:3)制备取代度(DS)为0.75的硫酸化青钱柳多糖SCP3。理化性质分析结果显示SCP3含有33.29%总糖、14.67%糖醛酸和10.36%蛋白质,分子量为2.19×10~5Da。单糖组成分析发现SCP3由6种单糖和2种糖醛酸组成,分别是鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖醛酸和葡萄糖醛酸,摩尔比为0.26:1.00:1.36:1.20:0.21:0.46:1.47:0.27。红外光谱图结果显示SCP3存在多糖的特征吸收峰和硫酸基团特征吸收峰,说明硫酸基团成功与多糖结合。紫外光谱图显示SCP3是一种含有蛋白质的杂多糖。扫描电子显微镜显示硫酸化修饰后,多糖的形态呈现碎片状和条状结构,表面更加粗糙,空隙更大。(2)以巨噬细胞RAW264.7为体外细胞模型研究了SCP3的免疫调节活性及分子机制。结果显示SCP3能够提高巨噬细胞的活力,增强吞噬作用,促进细胞内ROS含量的增加,活化下游信号通路。同时,SCP3可以增加ERK1/2、JNK、p38和NF-κB p65蛋白的磷酸化的表达,激活MAPK和NF-κB信号通路。此外,TLR4受体抑制剂能够阻断SCP3刺激巨噬细胞产生NO和TNF-α,以及下游MAPK信号通路磷酸化蛋白的表达,说明TLR4是SCP3激活下游信号通路的膜受体。最后,使用MAPK和NF-κB信号通路的特异性抑制剂进行验证,结果证明SCP3能够通过TLR4介导的MAPK和NF-κB信号通路激活巨噬细胞,促进TNF-α和NO的产生来发挥免疫调节作用。(3)通过脾淋巴细胞和环磷酰胺(CTX)诱导的免疫抑制小鼠为模型探究了SCP3的体内免疫调节活性及作用机制。结果表明SCP3能够提高正常小鼠脾淋巴细胞的增殖能力,与Con A和LPS可以协同促进T淋巴细胞和B淋巴细胞的增殖活性。通过细胞因子的测定,CP显著增加了TNF-α、IL-2和IFN-γ的生成,激活Th细胞分化成Th1型,而SCP3能显著增加TNF-α、IL-2、IFN-γ和IL-4的分泌,激活Th细胞分化成Th1型和Th2型,说明硫酸化修饰后SCP3能同时介导细胞免疫和体液免疫,提高了多糖对脾淋巴细胞的免疫调节活性。以CTX诱导的免疫抑制小鼠为动物模型,探究了SCP3对免疫抑制小鼠的免疫调节活性及可能的分子机制。结果表明SCP3能够提高免疫抑制小鼠的体重,缓解CTX造成的免疫器官萎缩以及血液指标的异常。并且SCP3能够提高免疫抑制小鼠的T、B淋巴细胞增殖能力,促进脾淋巴细胞分泌TNF-α、IL-10和NO,以及上调CD3+、CD4+和CD8+T淋巴细胞的比例。同时,SCP3能够提高肝脏的总抗氧化能力(T-AOC)、抗氧化酶(SOD、CAT、GSH-Px)的活性和降低丙二醛(MDA)含量来改善肝脏的氧化应激损伤。此外,SCP3在50 mg/kg剂量下显著促进My D88的表达,MAPKs信号通路中JNK、ERK1/2、p38蛋白的磷酸化,以及增加Akt、NF-κB(p65),IκB-α磷酸化和促进Ik B-α的降解。综上所述,SCP3能够通过My D88依赖的MAPK/NF-κB/PI3K-Akt信号通路来调节免疫抑制小鼠的免疫活性。(4)从肠道黏膜免疫的角度研究了SCP3对免疫抑制小鼠的肠道黏膜免疫调节活性。结果表明SCP3能够增加绒毛(Villus)长度和隐窝(Crypt)深度,提高了V/C值,减轻了肠腔的肿胀和细胞浸润。并且SCP3能够增加杯状细胞(GCs)的数量和黏蛋白的含量,改善肠道屏障,恢复了肠道形态的完整性,降低血清中内毒素结合蛋白(LBP)和内毒素(ET)含量。同时,SCP3能够增加Ig A分泌细胞的表达,提高肠道CD4+和CD8+T细胞的数量,促进肠道TNF-α和IL-1β的增加,以及提高肠道的抗氧化能力来调节肠道免疫。此外,SCP3还能提高小肠紧密连接蛋白ZO-1、Occludin和Claudin-1的表达来促进细胞间的紧密连接,增强肠道屏障,减弱肠道的通透性,防止细菌内毒素和病原微生物的入侵。(5)建立体外肠上皮细胞的氧化损伤模型,利用RNA-seq测序技术探究SCP3对肠上皮细胞氧化损伤的保护作用及分子机制。RNA-seq测序结果表明,空白对照组与模型组相比(B vs M),共有2630个差异基因上调,1082个差异基因下调;模型组与CP组相比(M vs CP),有393个上调,859个下调;而模型组与SCP3相比(M vs SCP3),有870个上调,1982个下调。KEGG富集分析结果显示,SCP3对IEC-6细胞氧化损伤的保护可能与MAPK和PI3K-Akt信号通路有关。根据基因组变化的相关信息,利用蛋白免疫印迹验证关键信号通路MAPK和PI3K-Akt信号通路中关键蛋白的表达。结果显示,H2O2显著增强了IEC-6细胞中MAPK信号通路的JNK、ERK和p38的磷酸化以及PI3K-Akt信号通路的Akt磷酸化表达,而SCP3对细胞的预处理明显减弱了H2O2对该通路的激活,减少了磷酸化蛋白的表达。因此,SCP3能够通过MAPK/PI3K-Akt信号通路保护肠上皮细胞免受氧化应激损伤。(6)通过肠道菌群研究了SCP3对免疫抑制小鼠的免疫调节作用机制。细菌16S r RNA测序结果表明,SCP3能够改变免疫抑制小鼠的肠道菌群结构,增加肠道菌群的多样性,调节特定细菌的相对丰度,包括增加了Bacteroidetes、Firmicutes、Tenericutes、Oscillospira和Akkermansia的丰度,以及减少Proteobacteriah和Verrucomicrobia的丰度。肠道菌群物种差异及标志物种分析结果表明g_Lactobacillus、g_Acidovorax、c_Chloroplast、g_Gemella、o_Streptophyta、f_Gemellaceae、o_Gemellales、g_Acinetobacter和f_Moraxellaceae可能与CTX诱导的免疫抑制的发病机制有关,而CP和SCP3影响免疫抑制小鼠的主要标志物种分别是g_Pediococcus、o_Bacteroidales、f_Prevotellaceae、g_[Prevotella]、f_Erysipelotricaceae和g_Clostridium、g_[Ruminococcus]、f_Dehalobacterium、g_AF12、g_Butyricimonas和f_(Odoribacteraceae)。此外,SCP3能显著增加结肠内容物总短链脂肪酸(SCFAs)、乙酸、丙酸、丁酸的含量。肠道菌落的功能预测发现,CP和SCP3对免疫抑制小鼠的代谢通路的影响可能主要与碳水化合物代谢、氨基酸代谢、脂肪酸的合成与代谢通路有关。(7)通过UPLC-Q-TOF/MS代谢组学研究了SCP3对免疫抑制小鼠的免疫调节作用机理。PCA和OPLS-DA分析发现CTX、CP和SCP3的处理能影响小鼠血清内源性小分子物质的改变。NC组和MC组之间一共鉴定出31种差异代谢物,MC组和CP组之间一共鉴定出29种差异代谢物,MC组与SCP3组之间一共鉴定出33中差异代谢物,而CP组与SCP3组之间鉴定出29种差异代谢物。通代谢通路分析,结果发现CTX主要影响小鼠的氨酰基-t RNA生物合成、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、苯丙氨酸代谢、泛素酮和其他萜类的生物合成、α-亚麻酸代谢、酪氨酸代谢这6条代谢通路。然后,CP和SCP3能分别从不同的代谢通路出发调节免疫抑制小鼠的血清代谢物。其中CP以脂肪酸的代谢为主,包括α-亚麻酸代谢和花生四烯酸代谢,而SCP3除了能进行脂肪酸的代谢(亚油酸代谢),还能影响氨基酸的代谢,包括苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成、苯丙氨酸代谢、氨基酰t-RNA生物合成等。与CP相比,SCP3对血清代谢物调节的代谢通路更多,且代谢物的调节更加趋向于向正常水平。将关键通路的11种关键代谢物与小鼠免疫指标,包括脾脏细胞因子(TNF-α、IL-6)、血液指标(WBC、RBC、PLT)和血清免疫球蛋白(Ig A、Ig M)、脾脏指数进行相关性分析,结果发现缬氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、(9Z、12Z、15Z)-十八碳三烯酸、花生四烯酸这6种代谢物与小鼠免疫指标具有显著的相关性,可以被作为多糖调节免疫抑制小鼠可能的内源性生物标志物。