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第一部分 PRRX1在非小细胞肺癌中的组织学表达特征及临床意义目的:通过检测PRRX1在非小细胞肺癌患者中的表达情况,结合患者临床资料,了解PRRX1在肺癌中临床价值。方法:利用免疫组化法检测52例非小细胞肺癌组织标本和28例癌旁正常肺组织标本中PRRX1表达情况,结合患者的临床病理资料和预后情况,应用Kaplan-Meier生存分析法和COX比例风险回归模型分析PRRX1与患者预后的关系。结果:1.免疫组化结果显示PRRX1在癌旁正常肺组织中呈现稳定中度表达;在非小细胞肺癌组织中PRRX1高度表达存在高分化的肺癌组织中,PRRX1中低表达存在中度分化的肺癌组织中,PRRX1低表达或者表达缺失存在于低分化的肺癌组织中。2.低表达PRRX1与患者的肿瘤大小分期,疾病分期和肿瘤分化程度相关(P=0.002,P=0.019和P=0.001)。3.COX比例风险回归模型多因素分析显示淋巴结分期、疾病分期和PRRX1表达水平是患者预后的独立因素(Cox回归分析:P=0.048,P=0.008和P=0.035)。4.PRRX1低表达患者生存周期较高表达者缩短(log-rank检验,P=0.010)。结论:PRRX1的表达情况与非小细胞肺癌患者的疾病分期、细胞分化、预后相关。低表达的PRRX1提示患者预后差。第二部分 沉默PRRX1诱导A549细胞经历EMT和获得CSCs特性目的:构建PRRX1基因沉默的PRRX1-shRNA-A549细胞模型,进一步研究在A549细胞中沉默PRRX1与EMT和CSCs特性的关系。方法:通过shRNA技术沉默A549细胞中PRRX1表达,构建PRRX1-shRNA-A549细胞模型。Western blot实验验证模型构建情况,应用MTT和软琼脂克隆生长实验观察模型细胞的增殖能力,相差显微镜观察细胞形态学变化。Transwell体外侵袭、入侵实验和创伤愈合实验检测模型细胞的侵袭和移动能力。Western blot实验和免疫荧光实验观察模型细胞的上皮和间质标志物表达情况。流式细胞仪分选模型细胞上肺癌CSCs标志物比例。结果:1.Western blot检测结果显示A549细胞中PRRX1为高表达,可以应用基因沉默技术构建细胞模型。2.成功构建PRRX1-shRNA-A549、Mock-shRNA-A549细胞模型,Western blot实验显示PRRX1表达明显抑制在基因沉默细胞模型中。3.MTT和软琼脂克隆生长实验结果显示,沉默PRRX1后,细胞贴壁和非贴壁增殖情况明显受到增强。4.相差显微镜下可见,沉默PRRX1后,A549细胞形态向间质细胞表型特征转化。5.Transwell体外侵袭、入侵实验和创伤愈合实验显示,沉默PRRX1后,细胞的移动和侵袭能力增强。6.沉默PRRX1后,A549细胞的间质细胞标志物Vimentin和N-cadherin表达上调,上皮细胞标志物E-cadherin下调,并且免疫荧光实验结果得到相一致的结果。7.流式细胞仪检测结果,细胞沉默PRRX1后,肺癌干细胞标准物(CD133、CD44、ALDH1)细胞比例提高,分别为77.6%、4.1%、1.5%。结论:敲除PRRX1诱导肺腺癌细胞经历EMT,获得CSCs特性,增强了细胞增殖、侵袭的能力。第三部分 沉默PRRX1通过干扰caspase-3凋亡通道激活抑制顺铂诱导的A549细胞凋亡目的:通过已经建立的PRRX1-shRNA-A549细胞模型,观察PRRX1沉默后,顺铂诱导的A549细胞凋亡和凋亡通道的变化,探讨PRRX1在顺铂诱导A549细胞凋亡中的作用机制。方法:通过MTT实验检测PRRX1沉默后顺铂对于细胞增殖抑制情况,并选择最佳顺铂实验浓度。流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡情况。线粒体膜电位检测线粒体体外膜电位的变化情况。Western blot实验检测凋亡相关蛋白(caspase-3,caspase-9,cytochrome C和Apaf-1)的表达情况,判断PRRX1沉默后细胞凋亡通道。MTT实验和细胞凋亡实验中添加caspase-3激活剂PAC-1,反向验证PRRX1沉默干扰的细胞凋亡通道。结果:1.MTT实验结果显示,PRRX1沉默后阻止了顺铂诱导的A549细胞增殖抑制,顺铂浓度为20μg/ml是后续实验最佳浓度。2.流式细胞仪检测细胞凋亡实验结果显示,PRRX1沉默后,细胞凋亡明显受到抑制。3.流式细胞仪检测细胞周期实验结果显示,PRRX1沉默后,细胞周期阻滞在G2期。4.线粒体膜电位检测结果显示,PRRX1沉默后,顺铂诱导的线粒体膜电位下降受到抑制。5.PRRX1沉默后凋亡相关蛋白caspase-3,caspase-9,cytochrome C和Apaf-1表达下降。6.添加PAC-1的MTT试验和细胞凋亡实验结果显示,细胞增殖受到明显抑制,细胞凋亡明显增加。结论:沉默PRRX1通过抑制线粒体膜电位下降和干扰caspase-3凋亡通道的激活,抑制顺铂诱导的A549细胞凋亡。