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目的:胃癌作为全球最常见恶性肿瘤之一,其主要采用以手术为主联合其他多种治疗方法的综合治疗模式。其中,免疫治疗已成为胃癌治疗中最具潜力的新手段之一。对于免疫治疗而言,肿瘤抗原的选择是肿瘤细胞免疫治疗的基础。目前尚缺乏结合东西方胃癌患者测序数据进行系统性筛选胃癌特异性高表达癌睾抗原（cancer-testis antigens,CTAs）的研究。鉴于此,本研究旨在筛选胃癌中高表达的新型CTAs,评估并分析候选CTAs在胃癌组织和人正常组织中的表达情况、评估其临床意义、探究其在胃癌中的功能及作用机制。方法:（1）通过分析癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）胃癌队列的转录组数据和基因表达综合（Gene Expression Omnibus,GEO）数据库下载的由亚洲癌症研究小组（Asian Cancer Research Group,ACRG）构建的胃癌队列（GSE66229）的表达谱芯片,结合CTDatabase数据库筛选胃癌中显著高表达的CTAs。（2）运用TCGA胃癌突变数据与国际癌症基因组联盟（international cancer genome consortium,ICGC）数据库中下载的我国胃癌患者队列（ICGC-CN）和日本队列（ICGC-JP）的突变测序数据来分析CTAs的突变频率,并分析其与肿瘤突变负荷（tumor mutational burden,TMB）的相关性。（3）结合TCGA、ACRG胃癌队列测序数据及兰州大学第二医院的87例（LUSH-GC）胃癌队列的免疫组化（immunohistochemistry,IHC）染色结果综合分析筛选出的候选CTAs在胃癌中的表达、临床意义及预后。（4）运用基因型-组织表达（Genotype-Tissue Expression,GTEx）数据库和兰州大学第二医院收集的正常组织标本（LUSH-NT）行IHC染色综合分析候选CTAs在正常组织中的表达特点。（5）对TCGA胃癌队列运用CIBERSORT算法评估肿瘤浸润免疫细胞,并用Spearman相关检验分析其与候选CTAs的相关性,并结合LUSH-GC胃癌队列行CD3、CD4、CD8、CD68、CD163、CD20的IHC染色对结果再次验证。（6）运用Western Blot、RT-PCR、免疫荧光（immunofluorescence,IF）方法分析候选CTAs在胃癌细胞中的表达及定位,并构建慢病毒介导的敲减/过表达候选CTAs的胃癌细胞株。（7）通过对TCGA胃癌队列和过表达/敲减候选CTAs胃癌细胞株的RNA-seq数据行基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis,GSEA）和基因集变异分析（Gene set variation analysis,GSVA）,确定其在胃癌中的潜在作用机制。（8）运用Cell Counting Kit-8（CCK8）实验、高内涵、平板克隆形成实验、Ed U细胞增殖检测、细胞增殖与示踪检测（Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester,CFSE）实验、流式细胞周期检测实验、Western Blot检测周期相关蛋白的表达、裸鼠皮下成瘤实验,进一步评估候选CTAs对胃癌细胞增殖作用的影响。结果:（1）在TCGA和ACRG胃癌队列中,共筛选得到14个差异表达CTAs,即TAD2、KNL1、NUF2、CEP55、CT83、IL13RA2、MAGEA3、MAGEA6、MAGEA12、KIF2C、PBK、TTK、ZNF165、IGSF11。（2）对突变数据分析发现,共有63个CTAs在TCGA、ICGC-CN、ICGC-JP队列中均发生突变,且具有突变CTAs的胃癌患者的TMB显著高于未突变CTAs的胃癌患者（P＜0.05）。（3）在TCGA、ACRG、LUSH-GC胃癌队列中,ZNF165在胃癌组织中的表达水平均显著高于癌旁组织（P＜0.05）。此外,ZNF165在肠型胃癌中的表达水平显著高于弥漫型胃癌（P＜0.01）。ZNF165在上皮表型的胃癌中的表达水平显著高于间质型（P＜0.0001）。ZNF165在高度微卫星不稳定（microsatellite instability-high,MSI）组的表达水平显著高于低度MSI组（P=0.0270）和微卫星稳定状态（microsatellite stable,MSS）组（P＜0.0001）。基于TCGA胃癌分型,ZNF165在MSI型中的表达水平显著高于基因稳定型（genomically stable,GS,P＜0.0001）。且ZNF165在GS型表达量显著低于EB病毒阳性型（Epstein Barr Virus,EBV,P=0.0046）和染色质不稳定型（chromosomal instability,CIN,P＜0.0001）。单因素及多因素Cox回归分析发现,ZNF165是接受基于氟尿嘧啶的化疗且行根治性切除的IB至IV期的胃癌患者总生存率（Overall survival,OS）和无复发生存率（Relapse Free Survival,RFS）的独立危险因素。（4）结合GTEx数据库和LUSH-NT队列分析发现,ZNF165仅在睾丸和胎盘组织高表达,而在其他正常组织均低表达或不表达。（5）ZNF165基因表达水平与肿瘤浸润免疫细胞评分（R=-0.2848,P＜0.0001）和基质细胞评分（R=-0.4261,P＜0.0001）呈显著负相关,而与TMB（R=0.3989,P＜0.0001）呈显著正相关。ZNF165表达与肿瘤浸润巨噬细胞M0型、巨噬细胞M1型、静息NK细胞、活化CD4+记忆T细胞和滤泡辅助T细胞呈显著正相关（P＜0.05）,而与静息肥大细胞、单核细胞、静息CD4+记忆T细胞、调节性T细胞和记忆性B细胞呈显著负相关（P＜0.05）。基于LUSH-GC胃癌队列验证发现,ZNF165表达水平与肿瘤浸润的巨噬细胞（R=0.2675;P=0.0128）呈显著正相关,与CD4+T细胞（R=-0.3685;P=0.0004）、B细胞（R=-0.2145;P=0.0448）呈显著负相关,与CD3+T细胞（R=-0.0805;P=0.4587）、CD8+T细胞（R=-0.1490;P=0.1788）和M2型巨噬细胞（R=-0.1884;P=0.0862）无显著相关性。（6）ZNF165在N87、MKN28和AGS细胞中高表达,而在KATO-III、MKN45、HGC27细胞中相对低表达。并成功构建并验证了慢病毒介导的敲减ZNF165的胃癌细胞株（MKN28和AGS）和过表达ZNF165的胃癌细胞株（MKN45和HGC27）。IF显示,ZNF165在胃癌细胞的细胞核和胞浆中表达。（7）RNA-seq测序结果分析发现,ZNF165显著富集在转录调控、细胞周期、错配修复、微管组织中心定位、调控中心体复制、中心体组装等信号通路。（8）通过CCK8、平板克隆形成实验、Ed U增殖检测、CFSE检测发现,敲减ZNF165能显著降低胃癌细胞的增殖,而过表达ZNF165可显著增强胃癌细胞的增殖。流式检测发现,敲减ZNF165的MKN28细胞和AGS细胞的G1期百分率显著高于对照组（P＜0.001）,而过表达ZNF165的MKN45和HGC27细胞的G1期百分率显著低于对照组（P＜0.01）。Western Blot检测发现,敲减ZNF165的MKN28细胞和AGS细胞的细胞周期相关蛋白phospho-CDC2、Cyclin D1、Cyclin E2、Cyclin B1、MAD2、TTK蛋白的表达量显著低于对照组（P＜0.05）。而过表达ZNF165的MKN45细胞和HGC27细胞的phospho-CDC2、Cyclin D1、Cyclin E2、MAD2、TTK蛋白的表达量显著高于对照组（P＜0.05）。裸鼠成瘤实验发现,过表达ZNF165的MKN45细胞成瘤瘤体体积显著高于对照组（P＜0.001）。过表达ZNF165组瘤体的Ki67和Cyclin D1表达显著高于对照组。结论:本研究系统分析了CTAs在胃癌中的表达及突变情况,并首次分析和验证了ZNF165在胃癌中的表达、临床意义、人正常组织中的表达特点、与肿瘤浸润免疫细胞的相关性、参与的信号通路及对胃癌细胞增殖作用的影响及作用机制。本研究表明,ZNF165在胃癌组织中显著高表达,特别是肠型、MSI型和CIN型胃癌。ZNF165仅在睾丸和胎盘组织中高表达,而在其他正常组织中不表达或低表达,具有很好的组织学特异性。而且ZNF165表达与肿瘤浸润促炎细胞呈显著正相关,可提高抗肿瘤作用。在功能方面,ZNF165可显著影响胃癌细胞增殖,并通过影响纺锤体组装检验点的表达水平调控胃癌细胞周期。ZNF165可作为胃癌患者免疫治疗的新靶标。本研究为以ZNF165为靶点的胃癌免疫治疗提供了新的理论基础。