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细胞自噬(autophagy)是从酵母到哺乳动物都高度保守的、降解胞内物质的过程。昆虫在幼虫-蛹变态期间发生着新老组织的更替,而自噬在其中发挥着重要作用。家蚕作为完全变态昆虫,在其蜕皮和变态期间发生着剧烈的自噬。自噬的发生是在多种自噬相关蛋白(autophagy-related protein,ATG)的参与下完成的,在酵母细胞中已对自噬相关蛋白ATG3/ATG8有较深入的研究。ATG3作为E2样蛋白酶,参与辅助ATG8发生磷脂酰乙醇胺(phosphatidyl ethanolamine,PE)化后完成自噬体膜的延伸。ATG8蛋白从酵母到哺乳动物高度保守,ATG8–PE是目前国际上检测自噬的标准之一,并在家蚕自噬中发挥重要作用。哺乳动物中LC3(酵母中ATG8的同源蛋白)参与细胞自噬并发生了亚细胞定位的变化,而昆虫中其同源物ATG8蛋白是否也存在此现象尚不清楚。另外ATG3作为辅助ATG8发生PE化的泛素样蛋白,是否在家蚕细胞自噬中发生亚细胞定位变化尚不清楚,所以本文根据我们前期研究发现对此展开了相关探索。首先对BmATG3/Bm ATG8蛋白抗体进行验证,证实抗体可以为实验开展所用,并检测家蚕5龄幼虫发育过程中BmATG3/BmATG8蛋白表达模式及亚细胞定位的变化;再利用杆状病毒超表达、RNA干扰及CRISPR/Cas9技术检测BmAtg3/BmAtg8基因在家蚕自噬中的功能及亚细胞定位的变化;利用20E或饥饿诱导BmN细胞自噬,观察内源及外源BmATG3/BmATG8蛋白亚细胞定位的变化;继而进行细胞核、质分离,探究BmATG3/Bm ATG8蛋白在细胞核、质中量的变化;进一步利用去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A(trichostatin A,TSA)处理BmN细胞,检测自噬和乙酰化的关系。获得的研究结果如下:1.BmATG3/BmATG8蛋白抗体验证及发育表达模式对BmATG3/BmATG8蛋白抗体验证,证实其可以为开展免疫荧光染色(immunofluorescent staining,IF)和蛋白印迹(Western blot)所使用。利用Western blot和IF方法分析BmATG3/BmATG8蛋白在家蚕5龄幼虫脂肪体内的发育表达模式,结果显示:BmATG3蛋白在自噬水平较低的摄食期具有较高的表达水平且主要分布于细胞核,而在自噬发生时蛋白表达水平下降,核内分布也相应降低。这一特殊表达模式暗示BmATG3蛋白在自噬过程中可能被大量消耗,或具有其他重要生理功能。BmATG8蛋白在自噬水平较低的摄食期主要以BmATG8全长形式存在,而在自噬发生时BmATG8–PE显著增加,且IF结果显示BmATG8蛋白细胞核定位减少,在细胞质中聚集形成自噬小点。2.BmAtg3/BmAtg8在细胞自噬中的功能研究杆状病毒介导超表达BmAtg3/BmAtg8均能促进家蚕脂肪体细胞自噬,而RNA干扰及CRISPR/Cas9敲除BmAtg3/BmAtg8后,则明显降低细胞自噬,由此证实BmAtg3/BmAtg8是家蚕脂肪体细胞自噬所必需。此外,RNA干扰BmAtg3/BmAtg8后抑制自噬降解底物P62的降解,进一步证实BmAtg3/BmAtg8是家蚕脂肪体细胞自噬所必需的。CRISPR/Cas9敲除BmAtg3影响BmATG8–PE形式的出现,使之不能在细胞质聚集形成自噬小点而定位于细胞核,由此暗示BmATG3可能参与辅助BmATG8正常出核参与自噬。同时,敲除BmAtg3引起家蚕提前进入游走后不能顺利化蛹而导致死亡,暗示BmAtg3可能参与家蚕生长发育的调控。3.20E及饥饿对BmATG3/BmATG8蛋白亚细胞定位的影响利用20E及饥饿处理BmN细胞诱导自噬启动后,Western blot结果可见BmATG8–PE水平明显增加,而BmATG3水平则降低,这与发育表达模式一致,且IF结果可见自噬启动后它们都在细胞质中聚集形成明显的小点,且细胞质内荧光强度较核内有所增加。外源转染BmAtg3-c-Myc/Flag-BmAtg8至BmN细胞再经20E及饥饿处理可观察到同样的现象。由此暗示自噬启动后,BmATG3/Bm ATG8蛋白可能从细胞核向细胞质转移,并在细胞质聚集成自噬小点。4.自噬发生时BmATG3/BmATG8在细胞核、质中分布的变化在正常营养条件下,IF实验结果显示内源及外源表达的BmATG3/Bm ATG8蛋白主要分布于细胞核,与核、质分离后Western blot结果一致。而经20E及饥饿诱导自噬后,Western blot结果显示细胞质中Bm ATG3/BmATG8蛋白有所增加而核中BmATG3/BmATG8蛋白有所降低。由此证实自噬发生后BmATG3/BmATG8蛋白从细胞核向细胞质转移。5.乙酰化修饰对家蚕细胞自噬的影响已有研究发现,LC3蛋白出核参与自噬与乙酰化修饰密切相关。从家蚕脂肪体细胞蛋白的整体乙酰化水平可见,在自噬水平较高的游走期一些蛋白乙酰化水平上升,而一些蛋白乙酰化水平则下降,特别是与BmATG8分子量大小(14kDa和12kDa)相近的蛋白乙酰化水平明显降低,暗示自噬发生时,BmATG8蛋白可能发生去乙酰化修饰。利用去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A处理BmN细胞后,Western blot检测发现与BmATG8分子量大小相近的蛋白乙酰化水平增加,而20E处理则明显降低该附近蛋白乙酰化水平,再次证实随着自噬的发生可能伴随着BmATG8蛋白的去乙酰化修饰。经20E及TSA处理BmN细胞,IF及Western blot结果发现TSA处理后,抑制细胞自噬,由此可见自噬的发生与乙酰化修饰密切相关。上述研究结果表明,BmATG3/BmATG8蛋白是家蚕自噬所必需,且正常营养状态下BmATG3/BmATG8蛋白主要分布于细胞核,而20E及饥饿诱导自噬发生可促进BmATG3/BmATG8蛋白从细胞核向细胞质转移。且TSA处理BmN细胞抑制自噬,暗示BmATG3/BmATG8蛋白参与细胞自噬与乙酰化修饰密切相关,而乙酰化修饰具体是如何调控自噬或者是否参与调控BmATG3/BmATG8蛋白出核等一系列问题都还有待研究。