【摘 要】
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目的:损伤时间推断是法医病理学研究中的重要内容,损伤时间推断具有限定犯罪时间、划定嫌疑人范围、认定损伤顺序、分析案件性质等重要作用。皮肤是人体最大的器官,也是抵抗外界刺激的第一道屏障,因此损伤时间推断多与皮肤组织相关。皮肤损伤愈合过程所涉及生物学过程错综复杂,损伤愈合过程还受自身因素和外界环境等因素的影响,因此准确的皮肤损伤时间推断是法医学实践中尚未解决的难点问题。微小RNA（micro RNA,
【基金项目】
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国家自然科学基金（No.81871529,81801874,81971793）；
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目的:损伤时间推断是法医病理学研究中的重要内容,损伤时间推断具有限定犯罪时间、划定嫌疑人范围、认定损伤顺序、分析案件性质等重要作用。皮肤是人体最大的器官,也是抵抗外界刺激的第一道屏障,因此损伤时间推断多与皮肤组织相关。皮肤损伤愈合过程所涉及生物学过程错综复杂,损伤愈合过程还受自身因素和外界环境等因素的影响,因此准确的皮肤损伤时间推断是法医学实践中尚未解决的难点问题。微小RNA（micro RNA,miRNA）作为一种内源性非编码RNA,在细胞的增殖、分化、迁移、凋亡等过程中起着重要的作用,广泛参与皮肤损伤愈合过程的各个阶段,同时miRNA具有物种间保守性、分子量小耐受死后变化、组织特异性、调控模式精密等性质。使miRNA在皮肤损伤时间领域表现出极大的潜力。越来越多的学者指出,作为miRNA常用的内参基因U6,存在明显的不足,并且U6在皮肤损伤愈合过程中和在死后皮肤组织中的稳定性评估也未见报道,因此我们筛选同种类型的RNA作为miRNA内参基因,与常用内参基因（U6,ACTB,GAPDH,5S,18S和LC-Ogdh）进行比较评估它们的稳定性,以期发现一组更稳定、更系统的miRNA内参基因体系,为进一步运用miRNA推断皮肤损伤时间奠定基础。研究方法:取健康成年C57BL/6雄性小鼠（8-12周龄）,体重20g-25g。实验前1天使用电动剃毛刀剃毛备皮,于小鼠背部正中用手术刀做一个1.5cm长的纵向皮肤全层切创,创口自然止血,不包扎、不给药。小鼠分为皮肤损伤愈合实验组和死后变化影响实验组,皮肤损伤愈合实验组分为:正常对照NC,皮肤切创12h、1d、3d、5d、7d、9d、11d、13d、17d、21d共计11个时间段,每个时间段随机分配5只小鼠;死后变化影响实验组为:皮肤切创5天,死后放置恒温恒湿箱中（温度（25±2）℃,湿度50%～60%）0d、1.5d、3d、4.5d、6d、7.5d共计6个时间段,每个时间段随机分配5只小鼠。运用二代测序技术,获取小鼠皮肤损伤愈合过程中的miRNA表达谱,筛选稳定表达的miRNA,作为miRNA候选内参基因。运用定量逆转聚合酶链反应（quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,RT-qPCR）技术检测皮肤损伤愈合过程中miRNA候选内参基因与常用内参基因的表达量及变化趋势,运用Ge Norm、Norm Finder、Best Keeper和ΔCt比较法综合评价这些基因的稳定性,用人体皮肤样品检验动物实验中评定为最稳定的内参基因的稳定性,用相关分析评价选定的miRNA内参基因的表达是否受年龄影响,最终得出皮肤损伤愈合过程中miRNA内参基因体系。研究结果:在皮肤损伤愈合实验组中,miRNA候选内参基因的Ct值范围从19.41（mmu-miR-26a-5p）到25.77（mmu-miR-409-5p）不等,表达量相对集中。常用内参基因Ct值范围从8.61（18S r RNA）到20.70（U6）不等,表达量相对较高,且基因之间表达量差异较大。根据四种算法给出的稳定性排名和综合排名,稳定性最好的三个基因分别是mmu-miR-26a-5p、mmu-miR-30d-5p和mmu-miR-152-3p,最佳的内参数为3个;在死后变化影响实验组中,稳定性最好的三个基因分别为mmu-miR-30d-5p,mmu-miR-152-3p和mmu-miR-26a-5p,最佳的内参数也是3个;在人体皮肤样本中miR-30d-5p,miR-152-3p和miR-26a-5p,仍是最稳的内参基因,并且它们的表达与年龄因素之间没有显著相关性。结论:1、miR-26a/30d/152在小鼠皮肤切创愈合过程中表达量的稳定性较好,且耐受死后变化的影响。2、miR-26a/30d/152在不同损伤时间的人体皮肤组织中表达量也较稳定,可作为皮肤损伤愈合过程中miRNA定量检测的内参基因,为采用miRNA作为生物学指标更准确推断皮肤损伤时间,并进一步解决死后变化对检验结果的影响奠定了基础。3、本研究显示,U6不适合作为皮肤损伤修复相关研究中基因类指标定量检测的内参基因。
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