卵巢是哺乳动物重要的生殖器官,排卵和调控与生殖性能密切相关。而卵巢颗粒细胞的增殖、凋亡和显著的功能分化对卵巢具有重要的意义,也是卵泡成熟所必需的。目前很多研究表明miRNA及相关基因在颗粒细胞功能发挥方面起着重要的调节作用。本课题组前期通过对猪黄体期和卵泡期卵巢组织进行转录组及miRNA测序分析,筛选出可能影响黄体期到卵泡期转变的关键miRNA及mRNA,筛选出候选基因miR-26a。本研究使用 Annexin V-FITC/PI 流式检测、qPCR、Western blot、ELISA 等技术研究了 miR-26a对猪卵巢颗粒细胞功能的影响以及其靶基因功能,并且使用双荧光素酶报告基因系统验证了 miR-26a与靶基因DHCR24和Smad4的结合位点。本实验旨在阐明miR-26a在猪卵巢颗粒细胞中的功能及其作用机制,以为深入了解猪卵巢颗粒细胞的凋亡机制,为阐明生殖内分泌遗传调控,深入研究卵泡闭锁奠定基础。本研究具体结果如下:1.Annexin V-FITC/PI流式检测结果表明,miR-26a能够促进猪卵巢颗粒细胞凋亡;使用ELISA技术检测表明,miR-26a能够抑制雌二醇、孕酮分泌。2.使用生物信息分析发现miR-26a在不同物种中保守性很高,随后使用生物信息学预测miR-26a与DHCR24、Smad4的结合位点。使用双荧光素酶报告基因系统结果表明,miR-26a能够靶向结合DHCR24、Smad4 3’UTR区域抑制报告基因荧光活性。qPCR和Western blot结果表明miR-26a在转录水平和翻译水平负调控DHCR24和Smad4表达。3.Annexin V-FITC/PI流式检测结果表明,干扰DHCR24和Smad4表达(转染si-DHCR24、si-Smad4),能够促进猪卵巢颗粒细胞凋亡;ELISA结果表明,干扰DHCR24表达抑制雌二醇和孕酮分泌,干扰Smad4表达促进雌二醇和孕酮分泌。以上结果表明,miR-26a通过靶向抑制DHCR24和Smad4表达促进猪卵巢颗粒细胞凋亡,并且可能是通过抑制类固醇通路中DHCR24的表达抑制雌二醇和孕酮的分泌。