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目的1.检测964例初诊恶性血液病患者ETV6基因突变的发生率，并对突变阳性标本进行ETV6基因重排与表达水平的检测，明确ETV6基因突变与重排及其表达水平是否有相关性。同时应用3D模式图模拟ETV6突变体对其蛋白结构功能的影响。2.应用芯片—比较基因组杂交（array-CGH）技术检测61例初诊恶性血液病患者12号染色体短臂（12p）缺失的发生情况，明确12p缺失对患者临床及预后的影响。3.检测158例初诊急性B淋巴细胞白血病（B-ALL）患者中免疫球蛋白重链（IgH）基因重排的发生率，并分析其临床特点及其他细胞遗传学特征。方法1.收集964例初诊恶性血液病患者的骨髓或外周血细胞。利用直接法或短期培养法制备染色体悬液，采用R显带进行核型分析。利用DNA抽提试剂盒（Invitrogen公司生产）抽提基因组DNA，应用聚合酶链反应（PCR）扩增基因组DNA，同时应用PCR产物双向测序的方法分析964例恶性血液病患者ETV6基因突变的发生情况，采用荧光原位杂交（FISH）技术及实时荧光定量PCR（RT-PCR）技术分别检测ETV6基因的重排与表达水平。综合分析ETV6基因突变与重排及其基因表达水平的关系，并对突变体所导致的蛋白结构域的改变进行分析。2.收集61例初诊恶性血液病患的者的骨髓或外周血细胞，应用利用DNA抽提试剂盒（Invitrogen公司生产）抽提基因组DNA，各自送检至少1.5mg DNA于上海伯豪生物技术有限公司，选用安捷伦人类比较基因组芯片（Agilent Technologies, SantaClara, CA, USA,244K）对61例患者进行array-CGH技术检测。同时应用送检公司所提供的软件（Agilent Genomic Workbench Lite Edition6.5software）进行数据与图像的分析，明确12号染色体短臂缺失的发生情况。3.选取158例初诊B-ALL患者的骨髓标本，应用短期培养法制备染色体悬液，采用R显带技术进行核型分析。选用位于14q32IgH基因两端的序列特异性探针（北京金菩嘉公司生产），应用荧光原位杂交技术（FISH）对158例患者的染色体悬液进行IgH基因重排的检测。结果1.964例恶性血液病患者中ETV6基因突变阳性的共15例，男性7例（n=501,1.4%），女性8例（n=463,1.7%），中位年龄为41（17-81）岁。其中急性髓细胞白血病有3例，（AML, n=296,1.01%），骨髓增生异常综合征有3例（MDS, n=94,3.19%），慢性粒细胞白血病急变期有2例（CML-BC, n=69,2.9%），急性B淋巴细胞白血病有3例（B-ALL, n=139,2.16%），慢性淋巴细胞白血病有2例（CLL, n=49,4.1%），急性杂合细胞白血病有1例（MPAL, n=36,2.8%），慢粒慢性期1例，（CML-CP，n=102,0.98%）而在非霍奇金淋巴瘤（NHL, n=36）、多发性骨髓瘤（MM, n=28）、急性T淋巴细胞白血病（T-ALL, n=53）及骨髓增殖性疾病中（MPN, n=62）均未发现ETV6基因突变阳性的标本。3例B-ALL阳性病例中，其中有1例同时伴随IKZF1基因缺失，4例AML阳性病例中有1例伴随RUNX1基因突变。突变阳性病例经ETV6基因重排检测结果均为阴性。通过应用RT-PCR技术对ETV6基因表达水平进行检测，发现ETV6突变阳性病例与阴性病例之间表达水平无明显差异。ETV6基因共8个外显子，阳性病例中突变位点位于2号外显子的有1例，位于3号及7号外显子的各有2例，位于4、5、6号外显子的各有3例，位于8号外显子的有1例。在蛋白水平进行分析发现突变位点主要累及PNT和ETS结构域以及二者的链接区。15例突变阳性病例中9例为移码突变（移码缺失2例，移码插入7例），错意突变4例，无意突变2例。其中移码突变及无义突变均可导致蛋白编码提前终止，产生截短的蛋白，从而影响ETV6基因的功能。应用FISH技术对73例伴有12号染色体异常的血液肿瘤患者进行ETV6基因重排的检测，发现经典重排阳性的有7例（9.6%），男性3例（3/44;6.8%），女性4例（4/29;13.8%），其中AML4例（4/24;16.7%），ALL2例（2/11;18.2%）， CML-CP1例（1/5;20%）。剩余患者中有12例为ETV6单倍体缺失，6例为部分缺失。结合染色体核型分析发现，7例阳性病例中染色体异常明确累及12p13的有6例，其中t(12;22)(p13;q12)所致的ETV6/MN1融合基因及t(3;12)(q26;p13)所致ETV6/MDS1融合基因文献已有报道。而其余染色体易位或缺失所致的ETV6重排的对手基因尚不清楚，可通过3’RACE或5’RACE技术来进一步明确对手基因。2.61例经Array-CGH技术检测的患者，发现伴有12p缺失的有12例，其阳性率为19.6%。其中AML2例（n=9;22.2%），ALL6例（n=22;27.2%），MPAL2例（n=15;13.3%），NK细胞型白血病1例，CML1例，MDS及MPN中均未发现阳性患者。阳性病例中染色体异常明确累计12号染色体的有6例，其精确性及灵敏性明显低于Array-CGH技术。经进一步分析发现缺失位置主要集中于12p12.3-12p13.2（11.4MB-17.0MB），并有11例患者同时伴ETV6基因的缺失（91.7%）。进一步经统计学分析发现，12例缺失阳性病例中男女性别比例为3:1，缺失阳性组患者的血红蛋白（HB）水平中位数为62.8g/L，明显低于未缺失组的94.1g/L，(p<0.05)。但在不同年龄、白细胞、血小板水平及总体生存期方面，两者的差异均无统计学意义（均P>0.05）。3.158例B-ALL患者中有11例（6.9%）检出IgH基因重排，其阳性细胞比例为10.5%~88.2%。结合染色体核型分析发现，11例阳性病例中同时伴随染色体核型异常的有9例，其中8例为复杂异常。9例染色体异常病例中明确累及14q32的有5例。不同染色体核型异常患者其IgH基因重排阳性率差异有统计学意义（P<0.05），其中染色体为复杂异常患者IgH基因重排阳性率（8/55）高于正常核型(2/52)及非复杂异常(1/51)。而不同性别、年龄及不同白细胞、血红蛋白、血小板水平患者IgH基因重排阳性率差异均无统计学意义（均P>0.05）。结论1.本实验通过对恶性血液病中ETV6基因突变进行筛选，发现ETV6基因突变在血液系统肿瘤中是一种再现性的事件，可见于MDS,B-ALL,T-ALL,CML,CLL等多种疾病类型,同时发现了多种新的基因突变类型。而且这些突变体通过自身结构的改变对ETV6基因的功能产生重要影响。2.通过Array-CGH技术对血液肿瘤中12p缺失的发生进行检测，证明（12p-）在恶性血液病中存在的普遍性及Array-CGH技术在检测小片段缺失方面的优越性。进一步验证了12号染色体短臂共同缺失区域集中于12p12.3-12p13.2（11.4MB-17.0MB），同时发现12P缺失多伴随ETV6基因的改变,并在一定程度上影响患者的临床表现。3. IgH基因作为一种常见的靶基因，其重排在多种血液系统疾病中都可见到。本实验通过对B-ALL中IgH基因重排进行筛选，证明IgH基因重排在B-ALL中有较高的发生率。同时FISH技术以其较高的敏感性及特异性对提高IgH基因重排的检出率起着重要的作用。