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葡萄球菌（Staphylococcus）是常见的病原菌之一,也是临床重要的病原菌,其产生的肠毒素、溶血毒素等给人类健康造成重大危害。因此,加强对致病葡萄球菌尤其是金黄色葡萄球菌及其相关ST型的早期筛查及防控至关重要。分子诊断技术因检测成本低、效率高、特异性强、灵敏度高等特点广泛应用于食源性病原菌检测。然而分子靶标的特异性及数量是限制分子诊断技术的最大因素。因此,搭建高效的分子靶标挖掘平台并建立相应的现场诊断（point-of-care testing,POCT）方法具有重要意义。本论文利用数值鉴定原理构建了常见葡萄球菌生化数值鉴定系统;通过泛基因组分析搭建了常见葡萄球菌分子靶标挖掘平台,获得葡萄球菌属/常见种和金黄色葡萄球菌重要ST型特异性新分子检测新靶标,并建立实时荧光定量PCR（Real-time fluorescence quantitative PCR,q PCR）方法;采用原核表达制备As Cas12a蛋白,并建立了基于PCR/RAA-CRISPR/Cas12a荧光检测、裸眼比色检测及试纸条便捷检测平台。本论文主要研究内容及结果如下:1)常见葡萄球菌生化数值鉴定系统研制及应用基于本团队葡萄球菌资源库,成功筛选了10种生化反组合用于鉴定22种常见葡萄球菌。通过生化实验建立生化反应阳性概率数据库,并开发了对应的鉴定软件。利用300株葡萄球菌分离株对该数值鉴定方法进行验证,鉴定准确率达到90%。2)致病葡萄球菌分子靶标挖掘平台及qPCR检测方法建立基于NCBI葡萄球菌全基因组序列,联合泛基因组分析,搭建了葡萄球菌属、常见菌种及金黄色葡萄球菌多位点序列分型（Multilocus Sequence Typing,MLST）分子靶标挖掘平台。在此基础上,获得葡萄球菌属靶标1个,四种常见葡萄球菌种靶标19个以及金黄色葡萄球菌三种重要ST型靶标6个。分别利用com FA、group＿14348、group＿26190和group＿26478靶基因建立了金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、溶血葡萄球菌和人葡萄球菌qPCR体系,在加标鸡肉样本中检测限（limit of detection,LOD）分别为5.2×10~3CFU/g、2.85×10~4CFU/g、3.17×10~4CFU/g、2.95×10~1CFU/g;选择金黄色葡萄球菌group＿10498、group＿9419、group＿9943靶基因分别建立ST7、ST188和ST398 q PCR方法,在加标样本中LOD为8.6×10~2CFU/m L、1.2×10~2CFU/m L、6.4×10~3CFU/m L。以上q PCR方法均展示出良好的特异性。将所建立的q PCR方法用于115份实际样本检测,展示出与传统检测方法一致性结果。3)Cas12a蛋白制备及基于CRISPR/Cas12a荧光检测金黄色葡萄球菌方法建立构建了Cas12a蛋白原核表达体系,制备出AsCas12a蛋白,该蛋白保质期6个月,剪切活性优于商业化LbaCas12a蛋白。利用目标dsDNA激活CRISPR/Cas12a的“反式切割”ssDNA特性,建立了常规基于核酸扩增的CRISPR/Cas12a荧光检测体系,整个检测需要40 min,对金黄色葡萄球菌展现了良好的特异性,在纯培养液及加标样本中的检测限分别为5.1×10~2CFU/m L和5.1×10~3CFU/m L,相对于传统的PCR方法提高了1-2个数量级。为进一步降低检测成本,利用氧化石墨烯（Graphene oxide,GO）与ss DNA单荧光探针之间的强荧光共振能量转移（Fluorescence resonance energy transfer,FRET）性能,采用荧光后淬灭策略,建立了GO-CRISPR/As Cas12a方法。结果显示:GO-CRISPR/Cas12a对目标菌表现出较好的特异性,灵敏度与传统CRISPR/Cas12a荧光方法一致,但检测信噪比有所下降。在实际样本检测中,常规CRISPR/As Cas12a方法和GO-CRISPR/As Cas12a方法检测结果与传统方法一致。4)CDA-ECP裸眼比色检测金黄色葡萄球ST398方法建立为进一步提高检测灵活性、降低对仪器设备的依赖,将金探针裸眼分析策略与CRISPR/Cas12a系统结合,建立了CRISPR/Cas12a裸眼比色（Enhanced colorimetric platform based on the CRISPR/Cas12a system and advanced DNA-Au NP probe,CDA-ECP）方法检测金黄色葡萄球菌ST398。该方法采用瞬时、超低温液氮冷冻法制备DNA-Au NP探针,利用CRISPR/Cas12a的“反式切割”ss DNA特性切割连接DNA探针,降解的连接DNA碎片不能与AuNP探针表面的DNA结合,从而使Au NP无法聚集而保持原来的鲜红色,最终通过颜色或吸光度变化检测目标物。结果显示:CDA-ECP对目标菌具有良好的特异性,对常见非目标菌具有较强的抗干扰能力,在50 min内对金黄色葡萄球菌纯培养液及加标样本的LOD分别为6.4×10~2CFU/m L和5.8×10~3CFU/g。将检测体系转移至96孔板,利用酶标仪测定其吸光度,CDA-ECP方法可用于24个食品样本高通量检测,检测结果与标准MLST方法结果一致。5)CRA-LFB便捷检测金黄色葡萄球菌试纸条的研制为实现基于CRISPR/Cas12a体系的现场诊断,研制出低成本、便捷检测金黄色葡萄球菌荧光试纸条平台（CRISPR/Cas-recombinase-assisted amplification based fluorescent lateral flow biosensor,CRA-LFB）。试纸条T、C线上分别标记捕获DNA探针和链霉亲和素修饰的BSA,利用CRISPR/Cas12a剪切ss DNA结合探针,当反应液加入后,读取荧光条带即可完成快速检测。该方法检测时间为70 min,对目标菌具有良好的特异性,对常见非目标菌具有较强的抗干扰能力,在纯培养和加标牛肉样本中的LOD分别为5.4×10~2CFU/m L和1.31×10~3CFU/g。综上,本论文构建了常见葡萄球菌生化数值鉴定系统,有效弥补了国内葡萄球菌数值鉴定的不足。搭建了致病葡萄球菌分子靶标挖掘平台,获得了一批具有自主知识产权的葡萄球菌相关分子靶标;制备出As Cas12a蛋白,建立了基于纳米材料淬灭荧光、金探针裸眼比色及试纸条策略的CRISPR/Cas12a新型分子诊断平台,克服了现有核酸检测技术热循环依赖、灵敏度偏低等缺点,大幅降低了检测成本,拓宽了CRISPR/Cas系统在分子诊断领域的应用,为葡萄球菌风险识别及快速检测提供新的思路。