海南番木瓜曲叶病病原遗传多样性分析及CRISPR抗病策略初探

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番木瓜(Carica papaya L.)是热带和亚热带地区重要的经济作物,其生产上主要的限制因子是病毒病。迄今已报道的病毒病主要有番木瓜环斑病、番木瓜畸形花叶病和番木瓜曲叶病。随着抗环斑病转基因品种的选育与推广,番木瓜环斑病得到了有效的控制,而有关曲叶病的报道呈明显递增趋势。据研究,番木瓜曲叶病的病原有番木瓜曲叶病毒(papaya leaf curl virus,PaLCV)、番木瓜皱叶病毒(papaya leaf crumple virus,PaLCrV)、番茄黄化曲叶病毒(tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)和胜红蓟黄脉病毒(ageratum yellow vein virus,AYVV)。它们均属于双生病毒科菜豆金色花叶病毒属,为单组分病毒,即仅含DNA-A组分。此外,该类病毒侵染时常伴随α和β两种卫星组分的传播。通过前期多次的环岛调查,研究发现番木瓜曲叶病在海南乐东和昌江有较大范围的爆发。为摸清乐东和昌江番木瓜曲叶病病原的遗传多样性,研究从这两个地区的种植园共计采集了 35份疑似染病样本;通过采用菜豆金色花叶病毒属A组分上CP元件的特异性引物BGCPF/R进行PCR分析,发现其中有26份样本成功扩增到目标条带;进一步的测序和同源比对分析表明,22份样本(约占总样本的62.86%)被确认为感染TYLCV,4份样本(约占11.43%)为感染AYVV;进化分析表明,TYLCV与AYVV的亲缘关系较远,而其内部的整体遗传多样性较低。为探讨利用CRISPR/Cas9技术防控TYLCV的策略,研究进一步从源自昌江的H1样本中分离了 TYLCV A组分的全长DNA,并根据序列信息设计了针对IR、Rep/C4、CP/MP基因不同位点的基因编辑载体。在构建的8个载体中,单切点载体6个(3个含GFP)、三切点载体2个(1个含GFP)。为评估不同载体的编辑效率,研究将含GFP的4个载体对本氏烟进行了转化,瞬时表达分析显示,各载体均有很好的抗病效果,其中,3个单切点载体的抗病效果差异不显著,而3切点载体显著高于3个单切点载体。综上,本研究发现海南番木瓜曲叶病的主要病原为TYLCV,其遗传多样性较低;同时,研究初步证实CRISPR技术可用于番木瓜曲叶病的防控,这为下一步的番木瓜抗病育种奠定了坚实的基础。
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