论文部分内容阅读
背景新型免疫调控因子TIPE2(Tumor necrosis factor–alpha-induced protein 8-like 2)是一种在炎症反应及免疫自稳过程中不可或缺的负性调控因子。先前发现TIPE2在小鼠体内的下调通常会导致致命性炎症。随着研究的进一步深入,有报道称TIPE2在人体内往往和自身免疫性疾病相关,主要表达于免疫组织和细胞中;在一些非免疫组织及细胞中也发现有表达,包括肝细胞,神经细胞,以及宫颈、胃肠道的上皮细胞等,提示在人体的非免疫器官及细胞中,TIPE2也可能具有一定的调节作用。目的阐明TIPE2在HCV感染后诱导肿瘤形成过程中所起的作用及分子机制。方法1.TIPE2与肝癌关系的确认1.1收集HCV阳性肝癌病人标本,包括癌组织及癌旁组织,利用Western blot比较TIPE2的表达差异。1.2以肝癌细胞系Huh7及正常肝细胞系Changliver为研究对象,分别建立TIPE2过表达及TIPE2沉默稳定株,继而进行生长曲线描绘、克隆形成实验、划痕实验等检测TIPE2对肝癌细胞、正常肝细胞的增殖、克隆形成能力及划痕愈合能力等的影响。1.3将上述建好的稳定株对裸鼠进行腋下注射,观察裸鼠成瘤情况。2.探讨HCV对TIPE2的调节作用2.1在293T细胞中将TIPE2分别与HCV编码蛋白(包括NS3/4A、NS5A、NS5B等)共转染,48h后Western blot检测哪个(些)编码蛋白对TIPE2的表达有影响。2.2在293T细胞中,将上述对TIPE2表达有影响的HCV编码蛋白与TIPE2共转染,利用免疫共沉淀和免疫荧光-激光共聚焦检测TIPE2与这些蛋白的相互作用情况。进一步在Huh7细胞中进行验证。3.检测TIPE2对DNA损伤通路的影响3.1将1中裸鼠的瘤组织进行组织切片,检测DNA损伤情况。3.2利用DNA损伤药物HU处理TIPE2过表达及TIPE2沉默稳定株,然后Western blot检测过表达、沉默TIPE2对DNA损伤/修复通路中关键蛋白H2AX、Chk1、Chk2等的磷酸化水平是否有影响。结果1.HCV阳性肝癌病人肝组织中TIPE2表达下调。2.HCV编码蛋白NS5A可以促使TIPE2降解。3.HCV编码蛋白NS5A与TIPE2可以相互作用,且在胞浆共定位。4.过表达TIPE2后,DNA损伤/修复通路中的关键分子γ-H2AX、p Chk1与p Chk2表达明显下降;沉默TIPE2后,γ-H2AX、p Chk1与p Chk2表达明显上升。5.过表达TIPE2后,细胞增殖速度、克隆形成能力及划痕愈合能力显著减弱。沉默TIPE2后,细胞增殖速度、克隆形成能力及划痕愈合能力显著增强。6.裸鼠皮下注射TIPE2过表达及对照组稳定株细胞后,过表达组的成瘤能力明显不及对照组;注射TIPE2沉默及对照组稳定株细胞后,沉默组的成瘤能力高于对照组。7.检测上述瘤组织中的DNA损伤情况,发现TIPE2过表达组未出现阳性着色颗粒,几乎不存在DNA损伤,而其相应的对照组中则出现大量阳性颗粒,DNA损伤严重;相反,在TIPE2沉默组其阳性着色颗粒明显多于对照组,DNA损伤情况较对照组更为严重。结论依据上述结果可以得知:TIPE2可以通过调控DNA损伤/修复通路参与HCV感染后诱导肿瘤形成的过程,研究结果为深入揭示HCV致癌机制提供了实验依据,为寻找新的抗肿瘤药物提供理论基础。