论文部分内容阅读
胃癌是一种严重危及人类健康和生命的消化道恶性肿瘤。胃癌的发生发展由多种因素参与,慢性幽门螺旋杆菌感染、多种信号通路分子及癌基因的激活、表观遗传学突变等均可能参与其中,具体机制仍不完全清楚。长链非编码RNA是一类长度大于200nt的内源性非编码RNA,其在肿瘤的增殖、分化、侵袭、炎症反应、代谢、血管生成等生物学过程起着重要作用。近来研究报道,lnc RNA SNHG3在胃癌组织中高表达,且与胃癌患者的生存预后密切相关,但lnc RNA SNHG3在胃癌中的生物学功能及其分子机制尚不明确。本研究从三个部分研究探讨lnc RNA SNHG3对胃癌细胞增殖、周期和迁移侵袭的作用,并阐明其分子机制。第一部分lnc RNA SNHG3在胃癌中的表达及临床意义分析目的:运用生物信息学方法筛选差异表达且与胃癌患者生存预后相关的lnc RNAs。在胃癌配对组织和胃癌细胞中验证候选分子lnc RNA SNHG3的表达情况,并统计分析其表达水平与胃癌患者临床病理学特征的相关性。方法:从TCGA数据库中下载胃癌组织和癌旁组织的测序数据及临床资料,运用Kaplan-Meier Plotter分析lnc RNA的表达水平与胃癌患者生存预后的关系;q RT-PCR检测候选lnc RNA SNHG3在胃粘膜上皮细胞GES-1和胃癌细胞系AGS、MGC-803、HGC-27、BGC-823,以及在26例临床胃癌组织和配对的癌旁组织中的表达差异;根据胃癌组织中q RT-PCR检测结果,将26例胃癌患者分为lnc RNA SNHG3低表达组和高表达组,分析与患者临床病理特征的相关性。结果:生物信息学分析结果显示,lnc RNA SNHG3在胃癌组织中的表达显著上调(P<0.01),其表达水平与胃癌患者的生存预后明显负相关(P<0.01)。q RT-PCR结果显示,与胃粘膜上皮细胞GES-1相比,lnc RNA SNHG3在AGS、MGC-803、HGC-27、BGC-823四株胃癌细胞中的表达水平显著升高(P<0.01)。lnc RNA SNHG3在26例胃癌组织中的表达显著高于癌旁组织(P<0.01),临床病理特征统计分析显示,lnc RNA SNHG3的表达与胃癌患者的临床分期相关(P<0.05)。结论:Lnc RNA SNHG3在胃癌细胞和组织中异常高表达,高表达lnc RNA SNHG3的胃癌患者生存预后较差,lnc RNA SNHG3的表达水平与胃癌患者的临床分期具有相关性。第二部分lnc RNA SNHG3对胃癌细胞的增殖、周期和迁移侵袭的作用目的:明确lnc RNA SNHG3在胃癌细胞的增殖、周期和迁移侵袭等生物学过程中的作用,以及敲降lnc RNA SNHG3对裸鼠体内成瘤能力的影响。方法:运用FISH实验检测lnc RNA SNHG3在四株胃癌细胞AGS、HGC-27、MGC-803、BGC-823中的亚细胞定位。运用si RNA小干扰和质粒转染技术分别在MGC-803、HGC-27细胞及BGC-823、AGS细胞中构建lnc RNA SNHG3敲降、过表达细胞模型,采用CCK-8和细胞克隆形成实验检测胃癌细胞增殖能力的变化;流式细胞术检测胃癌细胞周期的变化;Transwell和基质胶侵袭实验检测胃癌细胞迁移侵袭能力的变化。裸鼠成瘤实验观察敲降lnc RNA SNHG3后胃癌细胞在裸鼠体内的增殖能力。结果:FISH实验结果显示,lnc RNA SNHG3在AGS、HGC-27、MGC-803及BGC-823四株胃癌细胞的细胞核和细胞质内均有表达,以细胞质内表达为主。CCK-8增殖实验及克隆形成实验结果显示,与对照组相比,lnc RNA SNHG3敲降组的细胞增殖和克隆形成受到显著抑制(P<0.01);过表达lnc RNA SNHG3后,实验组的细胞增殖和克隆形成显著增强(P<0.01)。细胞周期检测结果显示,敲降lnc RNA SNHG3后,细胞周期被阻滞在G0/G1期,处于S期和G2期的细胞数量明显减少;而过表达lnc RNA SNHG3后,促进细胞周期由G0/G1期向S期和G2期转化,处于S期和G2期的细胞数量明显增加。Transwell和基质胶侵袭实验结果显示,与对照组相比,lnc RNA SNHG3敲降组细胞迁移侵袭能力明显下降(P<0.01);过表达lnc RNA SNHG3后,细胞迁移侵袭能力较对照组显著增强(P<0.01)。裸鼠成瘤实验结果显示,注射LV-sh-SNHG3细胞组瘤体的生长速度、体积明显小于对照组(P<0.01),瘤体的重量也明显低于对照组(P<0.01)。结论:Lnc RNA SNHG3具有促进胃癌细胞的增殖、周期进程、迁移侵袭的作用,能促进裸鼠体内胃癌细胞的增殖能力。第三部分Lnc RNA SNHG3/mi R-139-5p/MYB在胃癌中的作用机制研究目的:研究探讨lnc RNA SNHG3/mi R-139-5p/MYB在胃癌细胞增殖和细胞周期中的作用机制。方法:采用生物信息学方法分析预测lnc RNA SNHG3的lnc RNA-mi RNA-m RNA调控网络。分析TCGA胃癌数据库中mi R-139-5p和MYB的表达水平以及与胃癌患者的生存预后相关性;q RT-PCR分别检测四株胃癌细胞和26例胃癌组织及配对的癌旁组织中mi R-139-5p和MYB的表达情况。分析lnc RNA SNHG3与mi R-139-5p、mi R-139-5p与MYB序列之间的结合位点,并运用双荧光素酶基因报告实验和RIP实验进行验证。采用q RT-PCR检测lnc RNA SNHG3敲降或过表达后mi R-139-5p的表达变化;采用q RT-PCR和Western blot检测沉默或过表达mi R-139-5p对MYB表达水平的影响。设计回复实验,在胃癌细胞中共转染lnc RNA SNHG3过表达质粒和mi R-139-5p mimics,采用CCK-8、流式细胞术分别检测细胞增殖和周期的变化,采用q RT-PCR和Western blot检测MYB表达水平的变化,采用免疫组化、q RT-PCR和Western blot检测裸鼠瘤体组织中MYB的表达变化。结果:对TCGA胃癌数据的生信分析结果显示,在胃癌中lnc RNA SNHG3/mi R-139-5p/MYB之间存在三元调控关系。TCGA数据分析显示,mi R-139-5p在胃癌组织中的表达较对照组显著降低(P<0.01),MYB在胃癌组织中表达明显升高(P<0.01);mi R-139-5p表达水平与胃癌患者生存率呈明显正相关(P<0.01),而MYB的表达水平与胃癌患者生存率呈明显负相关(P<0.05)。同时,q RT-PCR结果显示,与对照组相比,mi R-139-5p在26例胃癌组织及四株胃癌细胞中的表达显著降低(P<0.01),而MYB在26例胃癌组织及四株胃癌细胞中的表达明显升高(P<0.01)。双荧光素酶实验和RIP实验结果显示,与转染GP-mir GLO-SNHG3 MUT组相比,GP-mir GLO-SNHG3 WT组的荧光素酶活性明显减弱(P<0.01);相对于对照组,anti-Ago2组中的SNHG3和mi R-139-5p显著富集(P<0.01);与pmi R-RB-Report TM-MYB MUT组相比,pmi R-RB-Report TM-MYB WT组的荧光素酶活性明显减弱(P<0.01),结果证实lnc RNA SNHG3的序列上存在与mi R-139-5p的结合位点,MYB序列的3’UTR上存在mi R-139-5p的结合位点。q RT-PCR结果显示,在胃癌细胞中敲降lnc RNA SNHG3后,mi R-139-5p的表达明显升高(P<0.01),而过表达lnc RNA SNHG3后,mi R-139-5p的表达显著降低(P<0.01);q RT-PCR和Western blot结果显示,相较于对照组,MYB在mi R-139-5p mimics细胞组的表达均显著下降(P<0.01),在mi R-139-5p inhibitor细胞组的表达明显上升(P<0.01)。回复实验结果显示,与对照组比,转染lnc RNA SNHG3过表达质粒后细胞的增殖能力显著增强(P<0.01),细胞周期由G0/G1期向S期和G2期转化增强,处于S期和G2期的细胞数量明显增加(P<0.01),并且MYB的表达水平明显升高(P<0.01);而共转染lnc RNA SNHG3过表达质粒和mi R-139-5p mimics组逆转了上述作用(P<0.01)。裸鼠瘤体免疫组化结果显示,Ki67和MYB在lnc RNA SNHG3干扰组的表达明显低于对照组;q RT-PCR结果显示,mi R-139-5p在lnc RNA SNHG3干扰组的的表达水平显著上升(P<0.01);Western blot结果显示,MYB在lnc RNA SNHG3干扰组的蛋白表达量明显低于对照组(P<0.01)。结论:Lnc RNA SNHG3通过ce RNA机制负向调节mi R-139-5p对靶基因MYB的抑制作用,从而促进胃癌细胞的增殖、周期进程等生物学功能,发挥癌基因作用。