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在所有的脊椎动物基因中,MicroRNA(miRNA)占了1%-3%,而miRNA几乎参与了生物体内所有的生理调控过程,miRNA的序列高度保守,表达具有时序性和组织特异性,这些特性表明了其参与生物功能的特异性,调控基因功能的复杂性。早就有研究报道,人类中有约30%的mRNA受到miRNAs的调控,包括疾病的发生、细胞分化与组织发育、细胞凋亡及生殖发育等。而其在性腺发育过程中,miRNA不管是对生殖细胞发育,还是性别分化,性腺成熟都有很重要的调控作用。而miRNA数量众多,miRNA-mRNA之间的结合常常是多对一或者一对多的调控关系,虽然大量的miRNA被发现,但是只有极少数的miRNA被确定其作用,许多其他miRNA的基因作用还未被阐明。因此,发现和确定miRNA的基因并分析靶基因的功能是了解miRNA在不同生理过程中的作用是非常必要的。青鳉是一种小型的,淡水养殖的稻田鱼,是进行发育生物学和细胞生物学等方面研究的良好模式动物,青鳉个体小、鱼卵透明、基因组小且有完整的序列、繁殖快、突变体成百上千,并且其二倍体胚胎干细胞系、单倍体胚胎干细胞系等都已经成功建立,这些资源为研究基因功能进行细胞生物学研究提供了良好的平台。除此以外,青鳉是唯一一个拥有雌性性别决定基因——Foxl3和雄性雄性性别决定基因——Dmy的脊椎动物,在过去的二十年里,很多科研工作者致力于对青鳉的研究,并且获得了良好的基础,发现很多生殖细胞标记基因,像dazl、dnd、piwi和vasa,并且也因此建立了很多相应的转基因品系,Morpholino、Talen以及Cas9等敲除技术均已在青鳉中成功应用,因此,青鳉是一个很适合研究性腺发育和性别分化的模式物种。目前,青鳉中也已经鉴定了一些和性腺发育相关的miRNAs,比如miR-430、miR-202-5p、miR-26a、miR-210等,不过,青鳉中非编码RNA的研究还很欠缺,一方面是青鳉中miRNA的报道并不多,另一方面是因为动物中miRNA-mRNA结合的特性(不完美匹配),使得miRNA的调控具有多样性及联合作用的特点,鉴于miRNA的功能广泛,研究miRNA的调控机制显得尤为重要和迫切。为了弥补这一块的空白,本研究在前期的研究基础之上,有针对性的选择了青鳉中对性腺发育有很重要影响的miRNAs,预测并验证了靶基因,通过对靶基因表达图谱的分析了解了miRNA和靶基因在青鳉性腺发育中的潜在作用。本研究首次通过青鳉鱼体内注射的方法以及双荧光素酶报告系统实验发现了青鳉中miR-202-5p和miR-26a的靶基因——ddx3x和ddx3y,并将ddx3x和ddx3y基因进行了克隆与表达分析。研究发现miR-202-5p和miR-26a的表达贯穿了青鳉的整个胚胎时期,并在三天左右时期表达量有明显的上调,结合前期的研究报道,猜测青鳉中miR-202-5p和miR-26a可能和生殖细胞发育息息相关。体内注射miR-202-5p的agomir和antagomir的结果显示,ddx3x和ddx3y基因在mRNA水平的表达确实有不同程度的上调和下调,并且和剂量有一定的关系,不同剂量注射结果显示,基因的表达趋势是一致的,此外,双荧光素酶报告系统进一步从结构上证明了miRNA-mRNA的结合位点。通过RT-PCR结果发现,ddx3x和ddx3y在精巢中均能检测到信号,其中ddx3y在精巢中表达量较高,ddx3x在卵巢中丰量表达,除了性腺以外,ddx3x在眼睛、肝脏、肾脏中也有表达,脑袋中有很弱的信号,揭示了ddx3x和ddx3y的广泛作用,通过序列比对发现两个基因有保守的DEAD-box结构域,以及ATP结合位点和RNA结合位点,显示出了DDX家族在物种进化中的高度保守性。原位杂交结果显示ddx3x分别在卵巢早期生殖细胞以及精巢的精子中表达,而ddx3y在精原细胞中表达,与其他物种中的结果一致,这和miR-202-5p也是一样的,均在性腺的生殖细胞中表达,研究证实了两个miRNA的靶基因,并分析了两个靶基因的表达图谱,揭示了这几个基因在青鳉性腺发育过程中的重要性,弥补青鳉中miRNA功能研究部分的不足,也发掘了新的和青鳉性腺发育相关的关键基因,为进一步了解青鳉性腺发育和相关基因功能的研究作了良好的铺垫。